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摘 要

应用电化学分析方法研究ε-聚赖氨酸与甲基橙的相互作用。循环伏安结果表明:甲基橙在裸玻碳电极上有一个氧化峰，ε-聚赖氨酸的加入导致峰电流减小和电位正移，表明两者发生了相互作用，两者之间的结合主要依靠静电力，并产生了非电活性复合物。应用循环伏安法结合等摩尔比法估测出甲基橙和ε-聚赖氨酸的结合比为50:1，结合常数为9.23×10³⁹。

关键词：甲基橙 ε-聚赖氨酸 电化学 循环伏安法

Electrochemical experiment on the interaction of ε-Polylysine Methyl Orange

Abstract

The interaction between ε-polylysine and methyl orange was studied by electrochemical analysis. The cyclic volt-ampere results show that methyl orange has an oxidation peak on the bare glassy carbon electrode. The addition of ε-polylysine leads to the decrease of peak current and the positive shift of potential, which indicates that there is interaction between them, and the combination between them mainly depends on electrostatic force. The non-electroactive complex was produced. The binding ratio of methyl orange to ε-polylysine was estimated to be 50：1 and the binding constant was 9.23×10³⁹ by cyclic volt-ampere method combined with equal molar ratio method.

Key Words: Methyl orange; ε-polylysine; Electrochemistry; Cyclic voltammetric method

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 绪论 1

1.1 ε-PL及其研究现状 2

1.2 甲基橙及其电化学研究进展 3

1.3 课题研究目的 5

第二章 实验部分 6

2.1 实验仪器 6

2.2实验试剂 6

2.3 实验方法 6

2.3.1 溶液的配制 6

2.3.2 电化学实验 7

第三章 结果与讨论 10

3.1甲基橙和ε-聚赖氨酸的循环伏安行为 10

3.2 甲基橙和ε-聚赖氨酸的相互作用 14

3.3 结合常数的计算 18

第四章 结论 20

参考文献 21

致谢 24

第一章 绪论

日本研究者S.shim和H.sakai在1977年，在提取放线菌的发酵液中发现了一种能大量产生Dragendo～Positive(简称：DP)物质的放线菌，该菌产生的DP物质很稳定^[1]。对该DP物质的酸水解产物和其结构进行分析，确定了这种DP物质是由一个赖氨酸残基上的α-羧基和另一赖氨酸残基上的ε-氨基连接形成酰胺键的一种含有25-30个赖氨酸残基的同型单体聚合物，称为ε-聚赖氨酸 (ε-polylysine，简称：ε-PL)^[2]。到目前为止，还没有研究者证实ε-PL是否具有二维或三维结构，因此只能根据ε-PL中所含赖氨酸分子数量的多少来确定其分子质量，因此得出了ε-PL分子质量的计算公式如下：分子质量=[146.19×n]-[18.02×(n-1)]^[3]。n=25～30的ε-PL分子量在3600-4300之间，其等电点为9.0左右，该分子量条件下的ε-PL的抑制作用做好，当分子量低于1300时ε-PL失去其抑菌活性。ε-PL是一种能溶于水微溶于乙醇，但不溶于乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂的复合物，其性状为黄色粉末，特点是吸湿性强，略有苦味，当分子量较高时具有良好的抑制作用是一种很好的食物保鲜防腐剂。ε-PL的理化性质较为稳定，受温度和pH的影响较小，在100℃，30min和120℃，20min热处理后均没有降解物生成，当其在高温条件下可以抑制耐热菌的活性，因此在对耐热菌进行热处理的时候可以加入ε-PL。ε-PL由于是赖氨酸的混合物，所以没有固定的熔点，但是温度达到250℃以上就开始软化分解^[3]。ε-PL的氨基残基容易失去电子而带正点，因此其容易和带负电的物质结合而使其活性产生变化，例如遇酸性多糖类、盐酸盐类、磷酸盐类等结合而使活性降低,当与盐酸、柠檬酸和高级脂肪甘油酯等一起使用又有增效作用^[3]。ε-PL结构式为：

ε-PL是一种具有抑菌功效的多肽，其很好的安全性和稳定性是作为食品添加剂的保障。ε-PL可以在人体内分解为赖氨酸，赖氨酸是人体必需的8种氨基酸之一，可以作为人体赖氨酸的来源，补充所缺赖氨酸，而且ε-PL不会在人体内残留，也不会有致癌性、致病性，因此ε-PL是一种营养型抑菌剂^[5]。2004年美国FDA批准ε-PL用于米饭、软饮料、蛋类制品、沙拉、鱼、奶酪、调味品等食品的防腐保鲜^[6]。我国在2014年正式批准ε-PL可作为食品防腐剂使用^[7]。ε-PL还可以和右旋糖酐反应产生的物质具有一定的乳化作用，因此还可以作为乳化剂使用。在饮食过程中，ε-PL可以抑制小肠对脂肪的吸收能力，从而达到减肥的效果，因此还可以作为食疗剂使用。由于ε-PL的阳离子特性，可以在细胞表面产生静电吸附作用，ε-PL吸附在微生物表面，破坏其细胞结构，使其失去活性，因此，ε-PL在医疗方面还有用途。

1.1 ε-PL及其研究现状

到目前为止，国内外研究者已经对ε-PL高产菌株的选育，发酵条件的控制及其合成机理进行了系统地研究^[8]。Itzhaki在1972年通过探究甲基橙与ε-PL间形成的复合物的特性，研究出了甲基橙法测定ε-PL含量。董惠钧和姜俊云是国内首批借鉴Itzhaki用甲基橙法测定ε-PL含量的研究者，由于ε-PL在发酵过程中发酵液成分复杂，这些因素使得测定受到影响，因此该方法测定的结果具有较差的重现性^[9]。因此，2006年曹伟峰等人对甲基橙法进行改良，应用控制变量法改变发酵液中的成分，研究每组成分对测定结果的影响，确定了甲基橙法测定ε-PL的最佳测定体系^[10]。得出的结论是（NH₄)₂SO₄、葡萄糖、L-赖氨酸和磷酸钠缓冲液对ε-PL的测定无影响，pH、 MgSO₄·7H₂O、甲基橙浓度等会对ε-PL的测定产生影响，溶液中MgSO₄·7H₂O的浓度小于0.06g/L时将不影响ε-PL的测定，过程中采用pH=6.6、0.1mol/L磷酸钠缓冲液来维持溶液的pH^[10]。实验探究了甲基橙浓度与ε-PL含量之间的线性关系，当ε-PL的含量低于100mg/L的时候测定结果更加准确^[10]。而文献^[11-12]报道甲基橙测定ε-PL的方法,未描述测定过程中MgSO₄·7H₂O及其他相关实验因素的影响^[10]。2009年,程传荣等人建立了 Dragendorff’s沉淀法,该法比甲基橙法测定的结果更准确,但是该法所用的发酵液中含有碱性物质，这种物质对实验测定的结果造成很大的干扰^[13]。骆健美，成永新等根据ε-PL抑菌作用的机理建立了微孔板生物检测法，该法比其他方法具有更良好的准确度和精密度,且操作简单、检测快速和节约实验材料,是一种更适用于大规模样品检测的方法,可用于发酵过程中ε-PL产量的定量和突变菌的高通量快速筛选工作^[14]。

1.2 甲基橙及其电化学研究进展

甲基橙（methyl orange，简称MO）是众所周知的酸碱指示剂，在高中大学实验中经常用来测定化学反应发生的变化。甲基橙在水中的溶解度较低，每升水中大概可以溶解1mmol的甲基橙，但是可以溶于乙醇等有机溶剂，其性状为橘红色块状或粉末。甲基橙作为分析化学中一种酸碱滴定指示剂，其浓度为0.1%的水溶液pH为3.1(红)～4.4(黄)，pHlt;3.1时变红，pHgt;4.4时变黄，当甲基橙呈现橙色时所对应的pH在3.1～4.4之间，该pH下的甲基橙适用于强酸滴定碱性溶液^[15]。在中性或碱性溶液中是以磺酸钠盐的形式存在，在酸性溶液中转化为磺酸，这样酸性的磺酸基就与分子内的碱性二甲氨基形成对二甲氨基苯基偶氮苯磺酸的内盐型式(成对醌结构)，成为一个含有对位醌式结构的共轭体系，所以颜色随之改变，不适用于作有机酸类化合物滴定的指示剂^[16]。董亦斌采用酸碱滴定法，以溴甲酚绿-甲基橙作混合指示剂，测定了工业用氟化锌中氟的含量^[17]。陈彩霞利用甲基橙可以被氧化还原的特性，以甲基橙作指示剂，用溴酸钾法测定异烟肼片剂的含量^[18]。黄典文利用甲基橙的还原性，采用溴酸钾使甲基橙氧化褪色的原理测定了淤泥中的微量As(Ⅲ)^[19]。甲基橙分光光度法也是日常卫生监督监测中常用的方法，例如万亚军用甲基橙分光光度法快速检测消毒剂中有效氯含量，陈玉宏建立了甲基橙褪色分光光度法测定酱中碘，经过实际应用，效果理想，方法简单，且干扰少、检出限低、稳定性好^[20-21]。

电化学分析法在有机和无机分析中有很大的用途，因为其测定精确度较好，所以经常用于对衡量元素进行分析，而该方法是由德国化学家C.温克勒尔在19世纪引入了分析领域^[22]。电化学分析方法的原理是基于物质的电化学变化，也就是以体系中的电位、电流或者电量作为体系中发生化学反应的量度进行测定的方法^[23]。通过对测定物质溶液中电化学性质的测定，得出的电极电位、电流等与测定溶液中物质的浓度及组成成分之间的关系，根据所得的电化学参数与浓度的关系，可以通过电化学信号确定其溶液中的物质组成^[24]。电化学分析法所用仪器设备操作简单，对物质测定选择性较好，测定的可控性强，而且灵敏度更高^[25]，因此该方法已经被广泛用于测定物质间的相互作用。例如：刘欢等人利用电化学发光法快速、准确地研究了喹菌酮、噻菌灵和 1，2-二羟基萘与 DNA 的相互作用，并且测定了其结合常数，讨论了相互作用和其物质结构之间的关系^[26]。杜芳静等人采用线性伏安法、紫外光谱法和红外光谱法研究了甲氨蝶呤与溶菌酶之间的相互作用，计算了两者的结合比和结合常数^[27]。循环伏安法测定原理简单，是电化学研究中最常用的方法，目前已被广泛地应用于化学、生命科学、能源科学、材料科学和环境科学等领域中相关体系的测试表征^[28]。王雪琳在甲基橙的光谱电化学研究中表明甲基橙在酸性条件下（pH=2～3）电还原，最终产物为N，N-二甲对苯二胺和对氨基苯磺酸，前者在 0.7v发生电氧化反应，其氧化产物为N，N-二甲基酸二亚胺，N，N-二甲基酸二亚胺发生两步水解脱氮反应生成酸亚胺和醌^[29]。陈毅挺在废水中甲基橙的电化学降解中对废水中的甲基橙降解机理做了初步的研究，结果表明，甲基橙与溶液中电解产生的羟基自由基发生了反应，使甲基橙内部显色基团的化学键发生断裂，从而达到脱色的目的^[30]。甲基橙分子结构中有的电活性基团是偶氮基-N=N-，因此甲基橙可以在电化学方法中做出相应的电化学参数，因而在电化学分析中具有较大的潜力^[16]。蒋治良等采用示波极谱检测技术，建立了测定痕量钨的催化示波极谱法，并用于矿石和钢样中钨的测定，该方法检出限较低，并且测定的浓度范围较广^[31]。周荣丰等利用阳极溶出伏安法测定硫酸铵底液中Sb(Ⅴ)，因为Sb(Ⅴ)和甲基橙可以形成三元配合物，所以用阳极溶出伏安法直接测定水体中Sb(Ⅴ)，检出限为0.1nmol/L，线性范围为0.26～5.2nmol/L^[32]。

1.3 课题研究目的

目前测定ε-PL含量的方法已经成熟，甲基橙法是应用最广泛，甲基橙法主要应用分光光度法，因为该方法不能反映出甲基橙法测定ε-PL的机理，所以本实验论文主要目的是用电化学方法测定甲基橙与ε-PL之间的相互作用，探究甲基橙与ε-PL的相互作用的电化学现象及计算其中的电化学反应常数，从而根据所得出的结合关系和结合常数建立一种测定ε-PL含量的电化学方法，对ε-PL的测定具有一定意义。

第二章 实验部分

2.1 实验仪器

表2-1 实验用仪器

2.2 实验试剂

表2-2 实验用试剂

2.3 实验方法

2.3.1 溶液的配制

1. 4000mg/L ε-PL溶液：使用精度为万分之一的电子天平准确称取1.0000g ε-PL，将称量好的样品置于100ml干净烧杯中，倒入50ml二次蒸馏水溶解，将溶解后的溶液倒入250ml的容量瓶中，重复上述两步步骤3次，最后将容量瓶定容至刻度线，容量瓶贴好标签，注明浓度。配好的溶液在使用时再逐级稀释至所用浓度。

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