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浮萍与新烟碱类杀虫剂吡虫啉和噻虫啉的协同转化

摘要：新烟碱类杀虫剂是世界上广泛使用的杀虫剂，通常在包括淡水在内的水环境中检测。我们首次报道了从美国爱荷华州的农业池塘采集浮萍与微生物系统对新烟碱类物质的协同转化。仅当浮萍及其相关微生物群落同时存在时，吡虫啉和噻虫啉才以统计学上无法区分的速率（分别为0.63plusmn;0.07和0.62plusmn;0.05day-1）从水培培养基中去除。作为浮萍-微生物协同作用的证据，与表面灭菌的浮萍、浮萍相关的微生物、单独的池塘水微生物以及其他两种植物物种（香蒲属和金鱼藻）的实验没有取得显着的新烟碱类杀虫剂去除超出初始的生物质吸附的效果。浮萍-微生物系统降解吡虫啉和噻虫啉产生多种已知的新烟碱代谢物（地硝基吡虫啉、吡虫啉尿素、噻虫啉酰胺和6-氯烟酸）。被测的昆虫或脊椎动物毒性增加的代谢物要么不存在（吡虫啉菲），要么只存在少量（地硝基吡虫啉；lt;1%的母体）。新烟碱类杀虫剂及其代谢物的质量平衡并未完全说明总的新烟碱去除量，仅表明矿化作用和/或其他未知毒性的转化产物。这种新的浮萍和微生物促进的新烟碱降解可能是新烟碱在环境中的转化研究的一个重要贡献。

导言

新烟碱类杀虫剂是世界上使用最广泛的。它们适用于多种常见的农业作物、住宅花园/草坪、树木，并用于宠物的虱子和蜱虫控制。新烟碱类化合物影响许多生态系统效应，包括传粉者和食虫鸟类的数量削减。部分是由于其用途广泛，应用量大，在水中的溶解度高，据报道，地表水中新烟碱类化合物的平均浓度为0.13mu;g/L，最高浓度（如320mu;g/L）要高得多。新烟碱类物质也存在于饮用水、雨水、地下水和废水中。

新烟碱类杀虫剂通过优先与昆虫烟碱乙酰胆碱受体结合的电负性硝基或氰基药效团发挥选择性毒性。这种选择性结合使得新烟碱类杀虫剂比许多农药更具针对性。然而，新烟碱类杀虫药效团通过微生物活动（主要记录在土壤微生物中）或非生物过程（例如光解）修饰可以改变结合特异性并随后影响非目标生物。例如：吡虫啉脱硝基后可产生去硝基吡虫啉，其具有正电荷分布的部分，影响受体结合并使该代谢物对脊椎动物的毒性比吡虫啉高出317倍（基于IC50）。去硝基吡虫啉可以进一步微生物转化为杀虫化合物吡虫啉脲和6-氯烟酸（6-CNA）；也已报道了6-CNA的矿化途径。

尽管，在全球地表水中频繁发现新烟碱类杀虫剂的存在，以及土壤微生物具有转化新烟碱类物质的能力，但对水生植物及其相关微生物群落转化新烟碱类的研究很少。最近一项研究报道表明，在浅水沼泽水中，新烟碱类化合物（包括吡虫啉）的浓度较低和检出频率较低与某些优势植物物种（如浮萍（Lemna turionifera））的存在高度相关。其他的优势植物，例如香蒲（香蒲（Typha latifolia）），与新烟碱检出频率较高和浅水沼泽浓度较高有关。然而，没有阐明任何植物物种的机制。以及在某些情况下浮萍与其相关的微生物群落可以转化水中的污染物，例如抗抑郁药，抗炎药，砷和酚。由于浮萍在全球水生环境中的流行，其促进的新烟碱类转化可能是一种关键的环境转化机制。因此，这项工作的目的是（1）确定浮萍和/或其相关的微生物群落是否可以从水中去除吡虫啉和/或噻虫啉；（2）量化选择的环境相关代谢物的形成，包括那些具有更大的昆虫或脊椎动物毒性

材料与方法

植物来源和新烟碱类杀虫剂实验。在爱荷华州约翰逊县的一个农业地区，收集了两种水生植物浮萍[Lemna spp，暂定为Lemna turionifera（图S2）]和鸡尾草（Ceratophyllum demersum）以及池塘水。植物实验是在恒温培养箱中的红色盒子中进行，与先前建立的方法相似，使用3.1minus;3.3g（鲜重）植物组织和10mL无菌过滤的0.5x Schenk和Hildebrandt培养基，pH6.0（特殊情况进行标注）。非特殊情况，进行三份平行实验。未灭菌的浮萍组织对新烟碱类杀虫剂的吸附实验在支撑信息中有所描述。使用我们之前建立的方法提取植物组织用于LC-MS/MS分析，并在支撑信息中注明了一些小改动。测试了吡虫啉和噻虫啉的转化以及已知代谢物的形成。吡虫啉是最广泛使用的新烟碱类之一，噻虫啉在结构上与之相似，但含有氰基而不是硝基作为杀虫药效团。处理包括（1）吡虫啉或噻虫啉加标培养基中未灭菌的浮萍，（2）加入吡虫啉培养基中未灭菌的浮萍（支撑信息中有方法细节）分离的微生物，和（3）浮萍，按照既定程序进行灭菌，并稍作修改，在含有吡虫啉和噻虫啉的培养基中培养。本研究中初始吡虫啉浓度（10-18.6mu;g/L）和噻虫啉浓度（2.4-6.0mu;g/L）在报告的全球地表水新烟碱浓度范围内。

此外，还对未经灭菌的浮萍与另一种未经灭菌的水生植物（“鸡尾草”，C.demersum）和来自同一浮萍源池塘的未经过滤的池塘水进行了平行测试。处理包括（1）鸡尾草和池塘水，（2）浮萍和池塘水以及（3）仅池塘水。所有处理的池塘水都去除了大型植物，并加入吡虫啉。支撑信息中提供了所有实验的实验设计，生长条件，采样，吸附测试和提取的全部详细信息。

分析方法和数据分析。分析方法和数据分析。通过与三重四极杆质谱仪偶联的高效液相色谱（Agilent 1260）分析样品（LC-MS/MS；具有MassHunter的Agilent 6460三重四极杆MS，版本B.07.00）在我们之前的工作中建立的多反应监测（MRM）正模式和电喷雾电离（ESI）中操作（表S1）。同位素标记的吡虫啉（d4）用作内标（用于培养基样品）或替代物（用于植物组织提取样品）。除非支撑信息中另有说明，否则使用d4-吡虫啉标准化的外部校准曲线来说明电离过程中的替代物回收率和基质效应。支撑信息中提供了完整的分析和质量保证详细信息。

用GraphPad Prism 8（GraphPad，La Jolla，CA）进行所有统计。匹配时间检验评估实验组和对照组之间的差异（alpha;=0.05）。在95%置信区间偏离线性的零斜率确定化合物浓度是否随时间发生显着变化。

结果与讨论

通过未灭菌的浮萍去除新烟碱类杀虫剂及其代谢物。未灭菌的浮萍（两种药物的plt;0.0001）从液体培养基中去除了吡虫啉和噻虫啉（图1a）的效果明显，而在非生物阴性对照的培养基中没有发现吡虫啉的去除[分别为p=0.12和p=0.29（图S6）]。因此，新生类固醇的去除是由生物过程驱动的，第一天浮萍组织的吸附量为2.6-2.7mu;g/L（图S7）。吡虫啉在培养基中的一级去除率[C₀=18.6mu;g/L；kplusmn;标准误差=0.63plusmn;0.07天^-1（图S4）]和噻虫啉[对于C₀=2.4mu;g/L;k=0.62plusmn;0.05天^-1（图S4）]在统计上是无法区分的[p=0.21（图S3）]。相似的速率表明，两种化合物之间的化学差异（包括硝基和氰基的效团）不会显着影响去除速率。

加入吡虫啉后，未经灭菌的浮萍处理在培养基中产生少量已知的吡虫啉代谢物（在任何时间点没有代谢物超过初始吡虫啉含量的6%）和植物组织（在任何时间点没有代谢物超过初始吡虫啉含量的0.1%）：去硝基吡虫啉，吡虫啉脲和6-CNA（图1b）。这些代谢物可能是浮萍促进的吡虫啉降解途径的一部分。有记录的吡虫啉降解途径包括从吡虫啉到去硝基吡虫啉到吡虫啉尿素到6-CNA到矿化终产物的细菌转化（图1c），这可能发生。吡虫啉尿素和6-CNA，两者都具有较低的杀虫性。亲本吡虫啉存在于治疗但不是非生物控制。在未经灭菌的浮萍处理中缺乏比亲本新烟碱（即去硝基吡虫啉）更具脊椎动物毒性的大量代谢物，加上没有测量的吡虫啉（比吡虫啉更具杀虫性），对浮萍植物修复具有潜在的积极意义。

图1：（a）未灭菌的浮萍处理和非生物对照中亲本吡虫啉和噻虫啉新烟碱类的质量平衡。去除每种新烟碱类代表协同浮萍-微生物降解。吡虫啉和噻虫啉在植物组织中均未以始终高水平发生，表明初始化合物的总体降解。初始条件：18.6mu;g/L吡虫啉（186ng）和2.4mu;g/L噻虫啉（24ng）。（b）在水培培养基和植物组织中测量的代谢物，报告为初始化合物的摩尔量。吡虫啉代谢物结果也在图S5中显示为扩展的y轴；吡虫啉和噻虫啉质量平衡的5%和33%分别在第6天关闭，表明可能存在其他代谢物和/或快速转化。这些代谢物。（c）文献建立了微生物降解途径。杀虫药效团呈红色。对于吡虫啉，在处理或对照中未发现吡虫啉烯烃；检测到其他代谢物。对于噻虫啉，两种代谢物都发生在浮萍处理中。误差线表示标准误差（n=3），其中不可见的误差线被数据符号遮挡。通过箱重测量来计算蒸散量。

先前鉴定毒性较低的代谢物噻虫啉酰胺和6-CNA存在于未灭菌的噻虫啉浮萍处理中。未灭菌的浮萍处理培养基中的噻虫啉酰胺（图1b）代表在给定时间点的初始噻虫啉质量的le;30%。噻虫啉酰胺也存在于浮萍植物组织上和/或浮萍植物组织中[le;初始质量的16%（图1b）]，但不存在于非生物对照培养基中（图S6b），表明是生物来源。噻虫啉酰胺的杀虫性低于噻虫啉，对脊椎动物的毒性低于噻虫啉。仅在LLD以下的浮萍处理培养基中发现6-CNA（图1b），并且仅在LLD附近的非生物对照培养基的单个重复中发现6-CNA（图S6b）。噻虫啉可以非生物地产生少量的6-CNA（例如，在进一步降解之前，非生物对照中的羟基自由基。在非生物对照的一个时间点仅在单个重复中存在6-CNA以及在非生物对照中缺乏显着的噻虫啉去除（图S6b）表明非生物合成6-CNA不是主要途径。相反，在几乎一半的噻虫啉-浮萍处理植物培养基中检测到6-CNA，少量重复。因此，6-CNA可以是浮萍系统转化噻虫啉的次要或快速转化的中间代谢物。总之，浮萍处理中噻虫啉酰胺和6-CNA的产生，加上噻虫啉的去除，表明毒性可能总体降低。

使用所选的市售代谢物，在未灭菌的浮萍处理中，实验结束时分别占初始吡虫啉和噻虫啉加入量的5％和33％。因此，在这些系统中可能发生测量的代谢物和/或具有未知毒理学结果的其他降解途径的进一步降解。

浮萍-新烟碱类转化的微生物协同作用。浮萍-微生物系统对吡虫啉和噻虫啉的降解似乎是协同的。单独的表面灭菌浮萍（图2）没有显着去除吡虫啉（在零时间112ng时p=0.13）或噻虫啉[t=0数据点忽略时p=0.30；第一天去除可能吸附浮萍组织（图S7）]。已经将浮萍迁移到液体培养基中的微生物已经证明了活力和生长[即，在平行电镀实验中（图S8b）]，在没有浮萍的情况下没有显着去除吡虫啉[p=0.84，标称C₀为10mu;g/L（图S8a）]。此外，来自同一浮萍源池塘的未消毒池塘水，代表池塘中的天然浮游微生物群落，没有显着去除吡虫啉[p=0.06，C₀为9.3mu;g/L，代表559ng吡虫啉（图3）]。因此，测试的两种新烟碱类的降解需要浮萍及其相关微生物群落的存在，表明浮萍-微生物降解过程是协同的。

图2：通过表面灭菌的浮萍从加有两种新烟碱（pH6.0）的0.5times;申克和希尔德布兰特的液体水培培养基中除去噻虫啉或吡虫啉。经表面消毒的浮萍并未显着去除吡虫啉（p=0.13）或噻虫啉（t=0数据点时p=0.30）。如另一项浮萍新烟碱吸收实验所建议的那样，在第一天去除浮萍很可能会吸附到浮萍组织上（图S7）。通过测量箱重解决蒸散问题。在零时，培养基中存在112ng（11.2mu;g/L）吡虫啉和60ng（6.0mu;g/L）噻虫啉。零时差的误差线表示标准误差，不可见的误差线被数据符号遮盖（n=1，零时=3）。

图3：用未灭菌的浮萍，未灭菌的凤尾鱼（C.demersum）和60mL去除吡虫啉（C₀=9.3mu;g/L，559ngIMI）的池塘水。未经消毒的天然微生物种群的池塘水未产生明显的吡虫啉清除（p=0.06），而未经消毒的浮萍处理则产生了显着的持续清除（plt;0.0001）。当在第一天的数据中，由于初始生物量的吸收而引起的损失被忽略时，去除尾尾处理并不显着（p=0.09）。由于采样导致的体积损失已计入结果；未测量蒸散量。误差线代表标准误差（n=4）。

此外，浮萍与微生物的协同作用似乎很明显，因为我们测试的并非所有未灭菌的水生植物都能降解新烟碱类。收集当地的香蒲属（“香蒲”）暴露于吡虫啉加标的培养基中，在7天时未显着除去吡虫啉[p=0.31，在零时刻吡虫啉为158mu;g（图S9）]。尽管尚不清楚确切的香蒲种类，但这一结果与Main等人的发现相对应，即宽叶紫草与新烟碱的检测频率更高，在浅水沼泽中的浓度更高。另外，从与浮萍相同的池塘中收集的另一种大型植物（C.demersum，“鸡尾草”）在最初的生物量吸附作用下并未除去吡虫啉[p=0.09（图3）]。在第0天到第1天之间，在尾尾处理介质中吡虫啉质量损失17％，与吡虫啉对浮萍的吸附测试的第一天的吸附损失21％相似（图S7）。

我们的结果证明用浮萍-微生物组合去除污染物并且用表面灭菌的浮萍去除或不去除污染物与先前文献的证据一致。例如，4-叔丁基苯酚被浮萍根的分泌物刺激的浮萍（螺旋藻）相关的根际细菌降解；然而，单独的浮萍不会降解该化合物。类似地，蓝藻和根际细菌之间的共生关系降解了苯酚。主要是芒草和小浮萍物种的组合增强了微生物布洛芬的去除。存在类似的关系，能够转化无机污染物；例如，只有当澳大利亚狼毒微生物群落与浮萍共同生长时才会发生亚砷酸盐氧化，而无菌浮萍则不会发生亚砷酸盐氧化。这项工作是浮萍-微生物协同作用降解新烟碱类的第一个记录实例。

环境影响，在全世界水生生态系统中普遍存在的浮萍可能在降解昆虫毒性新烟碱类和产生较少杀虫和较少脊椎动物毒性代谢物方面发挥重要的环境作用。通过浮萍处理吡虫啉和噻虫啉以及浮萍相关微生物群落的表

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