英语原文共 12 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

圣华金河谷颗粒在无细胞模拟肺液中形成的羟基自由基

摘要：之前的研究表明,心肺组织中颗粒物（PM）产生的不良健康效应与其导致的活性氧（ROS）形成有关。虽然羟基自由基（bull;OH）是最易起化学反应的活性氧物种，但是很少有关于颗粒物中羟基自由基形成的定量研究。这里我们将研究从加利福尼亚的圣华金河谷城市（夫勒斯诺市）和农村（韦斯特赛德）收集的颗粒物中形成的羟基自由基。我们使用无细胞的磷酸盐缓冲溶液（PBS）分别在有或者没有50 mu;M抗坏血酸盐（Asc）的情况下测定颗粒物提取液中的羟基自由基。结果显示通常情况下城市夫勒斯诺市的颗粒物比农村韦斯特赛德产生更多的羟基自由基。在提取溶液中生理相关浓度的抗坏血酸的存在增强了所有样品中羟基自由基的形成。一般地，按收集空气体积标准化后细颗粒物（PM_2.5）生成了比相应的粗颗粒（PM_cf，直径在2.5到10mu;M之间）更多的羟基自由基，然而按颗粒质量标准化后粗颗粒物生成更多的羟基自由基。当过渡金属螯合剂去铁胺（DSF）添加到提取溶液中后，由圣华金河谷颗粒产生的羟基自由基减少了平均（97 plusmn; 6） %，这表明了过渡金属的主导作用。在我们提取的颗粒中，通过测定铁、铜产生羟基自由基的标准曲线以及量化我们颗粒中铁、铜产生的羟基自由基，我们发现在圣华金河谷的颗粒物中磷酸盐缓冲溶液中可溶性铜主要贡献了羟基自由基的产生，同时铁也起重要作用。尽管高颗粒物浓度可以产生更多能引起细胞毒性的羟基自由基，根据我们的研究结果推断，日常暴露于圣华金河谷的颗粒物不太可能导致人体内肺液中产生大量的羟基自由基。

1.引言

流行病学研究显示环境颗粒物（PM）和不良的人类健康状况如肺和心血管疾病以及过早死亡有很大的相关性（Dockery等人,1993；Pope等人,1995；Pekkanen等人,2002；Pope 和 Dockery,2006）。有人提出颗粒物通过活性氧（ROS）的生成引起氧化应激和细胞损伤来产生毒性，活性氧例如过氧化根（bull;O₂^-）、过氧化氢（HOOH）和羟基（bull;OH）（Li等人, 2008; Valavanidis 等人, 2008; Gonzalez-Flecha, 2004; Donaldson等人, 2003）。这些活性氧被认为是在细胞中氧化磷酸化过程中形成的,溶解氧连续得电子依次导致过氧化根、过氧化氢、羟基的形成（Li等人, 2003）。如图1所示，活性氧也可以通过还原态过渡金属还原氧形成，过渡态金属通过还原剂如抗坏血酸盐再循环。

羟基是最活跃的活性氧，它可以在扩散控制速率常数下与大多数有机分子反应（Held 等人,1996; Forman 等人, 2010）。不像过氧化根和过氧化氢，可以分别通过超氧化物歧化酶和过氧化氢酶解毒，酶不能消除羟基。羟基会对细胞大分子产生各种各样的氧化损伤包括糖类、脂肪、蛋白质和核酸,从而导致细胞死亡和疾病（Valavanidis等人,2008; Kell, 2010）。因此，体外和体内实验中羟基的形成可能是一个有用的可吸入颗粒物潜在毒性指示物 （Cohn 等人, 2008）。用无细胞溶液提取颗粒生成的羟基也提供了关于颗粒物潜在氧化性的信息。几组人员已经做了这些类型的羟基测量，包括对于环境颗粒以及特定类型的颗粒（Shi 等人, 2003; Baulig等人,2004; Kunzli等人,2006; Jung等人,2006; Alaghmand 和Blough, 2007; DiStefano等人, 2009; Vidrio等人, 2009）。这些研究表明不同的颗粒可以通过化学方法生成大量的羟基自由基，通常情况下过渡金属在羟基自由基生成中起主要作用。

图1 过渡金属催化生成活性氧。TM代表过渡金属，Asc指抗坏血酸，（red）和（ox）代表还原和氧化形式。在这个方案中，还原态过渡金属给氧分子供电子，依次转化成超氧化物，过氧化物氢和羟基自由基。同时还原剂抗坏血酸盐（Asc）作为最终的电子供体。

过渡金属例如铁和铜是颗粒物中常见的可以生成活性氧的组分，都是直接通过化学反应和间接通过炎性细胞激活来引起氧化应激、炎症、诱变和细胞增殖，导致心肺疾病和癌症。（Kennedy 等人, 1998; Jimenez等人,2000；Hetland等人,2000；Prahala等人,1999; Ghio等人，1999；Knaapen等人,2002；Donaldson等人,2003；Schaumann等人,2004）。事实大概说明了过渡金属的重要性，颗粒物介导的活性氧生成和相关的细胞损伤可以由金属螯合剂去铁胺甲磺酸（DSF）抑制（Donaldson 等人,1997;Prahalad等人,2001;Alaghmand 和Blough,2007；Vidrio等人,2009;Shen等人,2011）。以前的研究也表明,铁和铜是产生活性氧最重要的颗粒过渡金属（Donaldson 等人,1997;Vidrio等人;2008;Shi等人,2003;DiStefano等人,2009;Wang等人,2010；Shen等人,2011;Nawrot等人,2009）。

为了表征在无细胞溶液中环境颗粒里活性氧的化学形成，之前我们测定了从加利福尼亚的圣华金河谷一个城市和农村收集的细颗粒物PM_2.5和粗颗粒物PM_cf产生的过氧化氢（Shen等人,2011）。在现在的研究中，我们测定了相同的圣华金河谷的颗粒产生的羟基自由基，为了（1）在同一模拟肺液中定量由颗粒产生的羟基自由基。（2）对比城市和农村在不同季节（夏天和冬天），采集不同颗粒大小（细与粗），所产生的羟基自由基。（3）探索添加抗坏血酸对羟基自由基的影响。（4）研究过渡金属，特别是铜和铁对羟基形成的作用。

2. 材料与方法

2.1 试剂

抗坏血酸（Asc, ge;99.0 %），钠型树脂Chelex-100，硫酸铜（II）（五水硫酸铜, 98 %, ACS试剂级），甲磺酸去铁胺（DSF, ~95 %TLC），硫酸亚铁（99.9 %）来自sigma。乙腈（CH₃CN）、硝酸（HNO₃、Optima），高氯酸（HClO₄, Optima），磷酸二氢钾（KH₂PO₄, HPLC级），苯甲酸钠（NaBA，ACS试剂级），氯化钠（NaCl、ACS试剂级）、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄，ACS试剂级）和硫酸（H₂SO₄、Optima）来自Fisher，亚硫酸氢钠（NaHSO₃）来自GFS化学，对羟基苯甲酸（p-HBA）来自美国TCI公司。超纯水（ge;18.2MOmega; cm）从Milli-Q系统（Millipore）获得。

2.2模拟肺液（SLF）

所有实验均在含有114 mM NaCl的无细胞模拟肺液液中进行，用磷酸盐（总磷10 mM：7.8 mM Na₂HPO₄ 和 2.2 mM KH₂PO₄）做缓冲溶液使pH 维持在7.2 到 7.4，并且用10mM苯甲酸钠作为探针来检测羟基。颗粒物提取前，使用Chelex-100去除模拟肺液中的过渡金属。然后冷藏模拟肺液，使用前一个月内准备。在大多数情况下,在样品提取开始前将新鲜配置的抗坏血酸以50 mu;M终浓度添加到模拟肺液中，模拟内源性的还原剂浓度。

2.3 颗粒物收集与提取

2006年到2009年间的夏季和冬季，由加利福尼亚大学戴维斯分校的其他研究人员在加利福尼亚圣华金河谷城市（夫勒斯诺市）和农村（韦斯特赛德）收集细颗粒特（PM_2.5）和粗颗粒物（PM_cf）样本。收集了总共12个样本，每个采样周期收集一个PM_2.5和一个PM_cf样本。然后把样本保存在零下二十度直至分析。尽管我们的储存时间相当长（大约一年到四年，表S1），我们不相信这会显著降低颗粒产生活性氧的能力，因为金属是颗粒中主要的氧化还原成分（表3.3），并且在每次实验时我们都添加新鲜的抗坏血酸到模拟肺液中。颗粒物质量用梅特勒—托利多XP26的1 mu;g精密天平来测定。一般地，同一样本PM_2.5的质量浓度比相应的PM_cf的浓度高。另外关于样本颗粒质量以及颗粒物质量提取效率（69–97 %）的信息是在我们过氧化氢的研究中（Shen 等人, 2011）。

为了测量羟基，少许滤膜（PM_2.5样本）或者小片箔（PM_cf 样本）被放置在7毫升的用硝酸预洗除去过渡金属的全氟烷氧基（PFA）聚四氟乙烯小瓶子中。添加6毫升模拟肺液和最终浓度为50 mu;M的抗坏血酸（在大多数的情况下）之后，瓶子用铝箔包严，放置在震动台上（VWR OS-500,设置“5”），在室温条件下避光摇晃24小时。对于一个样本，每个颗粒物的提取都是从同一的滤膜（或箔）上裁剪不同的部分（或块）进行测量，因此每个图上样品（n）的数量代表相同样本多个独立的测量值。每次实验，我们用处理颗粒物样本相同的方法 “提取”三种不同类型的对照样本（1）一个模拟肺液的空白处理，（2） 相应的外场空白，即滤膜或箔被放置在不采集样品的外场采样器内，（3）在含抗坏血酸的模拟肺液中加250 nM的硫酸铜作为阳性对照。为了检测过渡金属在羟基形成中的作用，在一些实验中，在加入抗坏血酸前加入螯合剂DSF到模拟肺液中（最终浓度为1.0 mM）。

2.4 羟基测定

在我们的实验中，用10 mM苯甲酸作为化学探针来测定羟基（Anastasio和 McGregor，2001；Jung 等人,2006）：因为在提取溶液中生成的羟基与苯甲酸反应形成对羟基苯甲酸，它是一个可由高效液相色谱量化的稳定生成物。高效液相色谱仪由岛津CMB-20A控制的SIL-10AF自动进样器、LC-10ATVP泵、 Keystone Scientifi 含有一个保护柱的C-18反相柱（3 times; 250 毫米, 5 mu;m填料）和岛津SPD-10AV紫外-可见检测仪（lambda; = 256 nm）组成。洗脱液由30%乙腈和70%水组成，用高氯酸调至pH为2，连续用缓慢氦气流（99.997 %）来脱气，并且以每分钟0.60 ml的流速来运行。颗粒物提取溶液在0、1、2和24小时摇晃后，取500 mu;l测定对羟基苯甲酸含量。提取液立即使用0.22 micro;m注射器式滤器（Milex Millipore）过滤，然后转移到自动进样瓶（Fisher Scientific），在进样瓶中与100 micro;M DSF和50 micro;M亚硫酸根离子混合使产生的羟基自由基猝灭。10分钟的暗处理后，添加5微升1.0 M的硫酸将提取液调至pH为2。在高效液相色谱仪分析前，储存在4到8度的环境中。

在同一天实验中，使用在模拟肺液中对羟基苯甲酸产生的标准曲线来定量每个样本中对羟基苯甲酸的浓度。每个样本中羟基浓度的计算使用（Jung 等人, 2006）：

[bull;OH] = [p-HBA]/（Y_p-HBA times;f_BA）

[p-HBA]是测量的对羟基苯甲酸的浓度，Y_p-HBA是在模拟肺液中羟基与苯甲酸反应中生成对羟基苯甲酸的摩尔产率（0.215plusmn;0.018）（Jung等人,2006），f_BA是羟基在特定模拟肺液中与苯甲酸反应的部分。基于已发布的羟基速率常数（Walling等人,1974；Buxton等人, 1988；Zepp 等人, 1992），我们计算出f_BA在没有抗坏血酸和螯合剂的情况下为0.9999，在有抗坏血酸时为0.9972，在有抗坏血酸和螯合剂时为0.8175。

我们使用相同的步骤去测定由DiStefano等人研究出的羟基生成速率，他们在37 ̊C，pH值为6.4，含500 micro;M水杨酸阴离子（SA，又名羟基苯甲酸甲酯）作为羟基化学探针和500 micro;M抗坏血酸的磷酸盐溶液中提取颗粒物。他们报道总量（R_2,3-DHBA R_2,5-DHBA），即羟基和水杨酸阴离子生成的产物2,3 -二羟基苯甲酸甲酯（2,3-DHBA）和2,5-二羟基苯甲酸甲酯（2,5-DHBA）的联合生成速率。我们使用一个类似于（1）式的方程来计算他们研究中羟基的生成速率（R_bull;OH）：

R_bull;OH = （R_2,3-DHBA R_2,5-DHBA）/((Y_2,3-DHBA Y_2,5-DHBA）times;f_SA）（2）

（Y_2,3-DHBA

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[28508]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word