文 献 综 述
1.1 课题背景
萤火虫荧光素(Firefly Luciferin)刚开始是人们从北美萤火虫腹部末端提取出的天然产物，是萤火虫荧光素酶的天然底物之一。在荧光素酶的催化下，萤火虫荧光素可以发出黄绿色生物光，波长范围在560nm到620nm之间[1] 。
刚开始人们是对荧光素的发光现象感到好奇，只探究了它的发光机理。但是随着研究的不断深入，许多生物发光应用不断的被发现，让荧光素成为了炙手可热的一种发光底物。生物发光有着十分广阔的应用前景，目前荧光素被广泛的应用在生物、医疗的发光应用中。作为生物发光的三要素之一的荧光素酶的”克隆”技术，已经广受世界学者们的关注。在我国，荧光素酶的”克隆”生成制剂技术作为863国家基金项目，也已经有了相当大程度的突破，未来荧光素酶的批量生产已可轻易实现。但同样是生物发光体系要素之一的荧光素却极不容易获得，如果单纯依靠生物提取的方式，从1.5万只萤火虫体内[2]，才能提取9毫克左右的荧光素，这种方式不但破坏了生态，而且还不能满足人们日益增长的需求。这一事实迫使我们只能通过人工合成的方式去合成荧光素，只要找到适合于工业化生产的荧光素合成技术，降低生产成本，就会使萤火虫的生物体发光体系的相关技术得到全面利用。因此，研发一条适合于工业生产的荧光素的新合成方法变得尤其必要。
1.1.1荧光素的发展历史
生物发光是自然界中一种有趣的现象。17世纪中业，丹麦科学家Thomas Bartholin首次在书中提出了生物体发光的概念。到了19世纪末，法国医学家Raphael Dubois[3]首先证明整个生物体发光三要素分别是荧光素、荧光素酶和氧分子这三种物质。而到了20世纪，人们对于生物发光的研究才进入了高速发展的时期。1936年，Destrians通过对萤火虫进行的一系列研究实验，首次发现了激发光的现象。早期对萤火虫荧光素进行详细研究的是霍普京斯大学的William D. McElroy[4]实验室，1949年的时候，他们首次分离出了荧光素的纯品。1957年，McElroy等人[2]首次得到了荧光素晶体。到了1963年，Emil H. White等人[5]首次通过人工合成的手段，完成萤火虫荧光素的全合成并确认了其结构。1965年，同样是White[6]等人首次尝试解释了生物体发光的反应机制。之后又有许多课题组尝试着解释荧光素的发光机制，直到2001年，日本科学家Keiko Gomi[7]等人，通过同位素视踪的方式，确认了荧光素的发光机理。2002年，吴若萍等人发现荧光素酶基因可以将活老鼠体内的前列腺癌细胞成像。这种技术可以帮助人们锁定癌细胞，再通过PLR技术在荧光素酶基因上附上含有细胞毒性的治疗基因，这样不仅可以有效的杀死癌细胞，还能避免健康细胞被杀死。

1.1.2荧光素的价值
二十一世纪以来，科学家们一直缺少一种有效的对生物体内活体细胞的观测的技术，仅仅通过常规的仪器，根本无法直接的观察到细胞活动的准确情况。而荧光素探针技术的诞生，恰到好处的解决了这个生物上的难题，对于活体细胞的研究，科学家们也不再是一种盲人摸象的行为。目前，生物荧光技术已经被广泛用于医疗，生物活体成像等领域。荧光素生物活体细胞点亮技术已经日趋成熟，尤其是在研究癌症的过程中，发挥着重要的作用。

1.2 荧光素的合成研究
萤火虫荧光素的化学合成思路来自于生物体内合成，比如甲虫类昆虫体内会分泌苯醌，苯醌和半胱氨酸反应，产生虫荧光素中的6-羟基苯并噻唑成分，当再添加半胱氨酸时便生成虫荧光素。人工合成的荧光素与天然荧光素几乎有着一样的生物活性，S Y.Lee 等[9]合成的7′-[123I]碘-D-荧光素可用于荧光素酶基因的体内表达研究。
D-荧光素大多都是以半胱氨酸为主要原料来进行人工合成鉴于D-萤火虫荧光素独特的生物发光性能.
1.2.1 White 组全合成
1963年，White课题组[5,8]在JACS上报道了一篇以人工的手段合成萤火虫荧光素的全合成路线，这也是第一篇关于人工合成D-荧光素的全合成报道。在这篇报道中他们设计了一条总共8步的反应，完成萤火虫荧光素的合成，反应路线见图1-1。
他们使用了原料对甲氧基苯胺18首先与草酸二乙酯19进行酰胺化反应生成产物20，化合物20与五硫化二磷反应，取代掉一分子氧得到到硫羰基化合物21，随后使用铁氰化钾作为氧化剂，氧化之前的硫羰基化合物21进行关环脱水反应得到羧酸产物22，接着脱水产物22依次进行酯化、氨化、脱水等反应得到关键中间产物25，25在吡啶盐酸盐中加热发生脱甲基化反应得到1，1再与D-半胱氨酸发生反应得到目标产物27。反应的总产率为5.8%。

图1-1 White等人的D-荧光素全合成路线
Fig. 1-1 The total synthesis of D- luciferin by White et al
1.2.2 Seto 等人合成路线
同年，Seto等人[9]经过5步反应合成了萤火虫荧光素。(图1-2)
在Seto的合成路线中，原料同样为对甲氧基苯胺18，它首先与氨甲酰硫代羰基硫代乙酸28反应生成氨甲酰硫代羰基对甲氧基苯胺29，产物29在铁氰化钾的氧化关环作用下得到化合物24，随后三氯氧磷使氧化羧酸衍生物24脱去一分子水，反应得到2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑25，接着脱水产物25在吡啶盐酸盐的作用下得到衍生物1，化合物1与D-半胱氨酸发生反应得到目标产物27。
Seto的反应路线大大缩减了White等人的反应步骤，但是因为反应中使用的硫代产物并不稳定，反应的总产率也仅仅提高到6.5%。

图1-2 Seto等人的D-荧光素合成路线
Fig. 1-2 The total synthesis of D- luciferin by Seto et al.

1.2.3 White等人改进合成路线
1965年，White等人[6]又重新设计了一条合成D-荧光素的反应路线，仅仅利用4步反应，就完成了D-荧光素的合成(图1-3)。

图1-3 White改进路线
Fig. 1-3 The improved route of D- luciferin by White et al.
他们以2-氨基-6-甲氧基苯并噻唑28作为原料，与亚硝酸生成重氮盐，接着立即进行氯取代反应，成2-氯代-6-甲氧基苯并噻唑29，氯代产物29在吡啶盐酸盐作用下脱去甲氧基上的甲基得到产物30，中间体30与氰化钾发生氰基取代反应得到中间体1，化合物1与D-半胱氨酸发生反应得到荧光素28。反应的总产率大大提高，最终为21%的总收率。
1.2.4 Yoshiaki合成路线
1992年，D-荧光素的合成路线又被Yoshiaki等人[10]大大的缩短，他们在White改进路线的基础上，仅仅利用3步反应就完成了萤火虫荧光素的合成(图1-4)。

图1-4 Yoshiaki合成路线
Fig. 1-4 The synthetic route by Yoshiaki et al.

他们同样以2-氨基-6-甲氧基苯并噻唑28作为原料，但与White不同的是，在亚硝酸在酸性条件下反应，生成重氮盐后，直接进行氰化取代反应生成2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑25，氰基衍生物25与吡啶盐酸盐发生反应脱去甲氧基上的甲基得到中间体1，化合物1与D-半胱氨酸发生反应得到D-荧光素27。反应的总产率为34.7%。

1.2.5 Santaniello课题组合成路线
2009年，Santaniello课题组[11]以White路线为基础，设计了一条9步的反应路线(图1-5)，并改良了其中的一些步骤。他们同样以对甲氧基苯胺作为原料，与White相同的路线得到20、21，接着先水解，然后酸化得到羧酸21，21经过铁氰化钾关环得到产物31，之后经过同样的步骤得到D-萤火虫荧光素27。经过他们的改良后，反应总收率提高到9%。

图1-5 Santaniello课题组路线
Fig. 1-5 The synthetic route by Santaniello et al.

1.2.6 Prescher课题组的合成路线
2012年，Prescher课题组[12]设计了一条新的合成路线(图1-6)，他们设计的初衷是为了能更好的研究荧光素衍生物，同时他们认为White的全合成路线略显繁琐，并且噻唑环无法被替代，这样不利于荧光素衍生物的合成。因此，他们设计了一条全新的路线，来得到荧光素底物。同样的，Prescher以对甲氧基苯胺作为原料，与二噻唑化合物32加成得到化合物33，接着与DBU(二氮杂二环)反应得到氰基化合物34，在催化剂的作用下氧化关环，得到产物25，接着进行脱甲氧基上的甲基，与D-半胱氨酸发生反应得到D-萤火虫荧光素27。

图1-6 Prescher课题组路线
Fig. 1-6 The synthetic route by Prescher et al.