摘 要

壳聚糖作为天然碱性高分子多糖是甲壳素脱乙酰化后得到的产物，其拥有优秀的生物相容性。而羧丁酰壳聚糖(NSC)则是壳聚糖通过与丁二酸酐反应，以到达引入酰胺基的目的。本就具有氨基的生物分子在引入酰胺基后具有更加优异的性能，如具有壳聚糖所没有的溶解性。仅是如此还不够，加上用胶原蛋白肽改性，能够使所得产物具有特殊的生物活性，使得该产物更加符合当前人们对水凝胶的要求。而使用氧化普鲁兰作为交联剂，则是因为该物质是糖类物质，易降解，同时对于形成水凝胶结构具有较好的促进作用。本文是以壳聚糖、普鲁兰、胶原蛋白肽为材料，制备新水凝胶。研究内容如下：

使用丁二酸酐将壳聚糖改性为羧丁酰壳聚糖，而后将胶原蛋白肽接枝到羧丁酰壳聚糖上，即制得反应物单体。接着将普鲁兰氧化后的产物氧化普鲁兰作为交联剂，使羧丁酰壳聚糖-胶原蛋白肽分子间交联，即可获得水凝胶样品。最后，对水凝胶进行结构表征。结果表明实验样品结构与成品水凝胶基本相似，即实验成功。之后进行性能测试，如溶胀性、水蒸发率等，探究加入的氧化普鲁兰对于样品水凝胶的性能的影响。

关键词：羧丁酰壳聚糖；胶原蛋白肽；氧化普鲁兰；水凝胶。

Abstract

Chitosan, as a natural alkaline macromolecule polysaccharide, is the product of deacetylation of chitin. It has excellent biocompatibility. Carboxybutyryl chitosan (NSC) reacts with succinic anhydride to introduce amide groups. Biomolecule with amino group has more excellent properties after introducing amide group, such as solubility that chitosan does not have. This is not enough, and the collagen peptide modification can make the product have special biological activity, making the product more in line with the current requirements of hydrogels. The use of oxidized pullulan as crosslinking agent is because it is a saccharide, easy to degrade, and has a good role in promoting the formation of hydrogel structure. In this paper, a new hydrogel was prepared by using chitosan, pullulan and collagen peptide as materials. The research contents are as follows:

Chitosan was modified into carboxybutyryl chitosan by succinic anhydride, and then collagen peptide was grafted onto carboxybutyryl chitosan to prepare the monomer of the reactant. Then, the oxidized product of pullulan was used as cross-linking agent to cross-link carboxybutyryl chitosan-collagen peptide, and the hydrogel samples were obtained. Finally, the structure of the hydrogel was characterized. The results show that the structure of the experimental sample is basically similar to that of the finished hydrogel, that is, the experiment is successful. After that, performance tests, such as swelling, water evaporation rate and so on, were carried out to explore the effect of adding oxidized pullulan on the performance of sample hydrogels.

Key words: N-succinyl chitosan; Collagen peptide; Oxidized pullulan; Hydrogel.

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1引言 1

1.2水凝胶 1

1.2.1水凝胶的定义 1

1.2.2水凝胶的分类 1

1.2.3水凝胶的制备方法 2

1.2.4水凝胶在医用领域的应用 3

1.3壳聚糖及其衍生物的概述 3

1.3.2羧丁酰壳聚糖的概述 4

1.4胶原蛋白肽的概述 5

1.5转谷氨酰胺酶的概述 6

1.6普鲁兰及其衍生物的概述 6

1.7选题依据和主要研究内容 7

第二章 羧丁酰壳聚糖-胶原蛋白肽/氧化普鲁兰水凝胶的制备和性能研究 8

2.1引言 8

2.2羧丁酰壳聚糖-胶原蛋白肽/氧化普鲁兰水凝胶的制备及表征 8

2.2.1实验仪器及试剂 8

2.2.2羧丁酰壳聚糖（NSC）的制备 9

2.2.3羧丁酰壳聚糖-胶原蛋白肽（NSC-COP）的制备 9

2.2.4氧化普鲁兰的的制备 10

2.2.5羧丁酰壳聚糖-胶原蛋白肽/氧化普鲁兰水凝胶的制备 10

2.2.6水凝胶的红外表征 10

2.2.7水凝胶的扫描电镜测试 10

2.2.8水凝胶的各项性能测试 11

2.3结果与讨论 11

2.3.1红外光谱分析 11

2.3.2扫描电镜测试 13

2.3.3凝胶时间 14

2.3.4水凝胶溶胀性 15

2.3.5水凝胶水蒸发率 16

2.3.6水凝胶的溶血性能 16

2.4本章小结 17

第三章 结论 18

致谢 19

参考文献 20

第一章 绪论

1.1引言

当今社会和科学技术的日新月异，高分子材料越来越引人注目。在生物和医学领域中，高分子材料大放异彩，如同夜空中的月亮，激起人们对高分子材料的好奇心，并成为人们主动研究并开发高分子材料的不竭动力。

水凝胶就是脱颖而出的一种高分子材料，它兼多种材料独有的突出的性能于一体，不知不觉中成为了人们开发应用的主要对象。在生物医药，化工等方面，水凝胶以其出类拔萃的性能被广泛使用。壳聚糖时因为其来源丰富、对人体伤害小的特点，走入人们的视线，并引发人们对它的不懈的研究。因此，当水凝胶以壳聚糖来制作时，一种新颖、性能优良、经济使用的高分子材料便应运而生了。

1.2水凝胶

1.2.1水凝胶的定义

通过互相交联形成的具有三维的网状结构的线性高分子链^[1]，可以在维持其网状结构能力的情况下吸收大量液体使自身溶胀并成为凝胶状物质，这种物质便是水凝胶。水凝胶的结构很特别，类似于亲水性物质，能够牢固地锁住吸入的大量的水分，同时，水凝胶又如同疏水性物质，不会溶于水中。总体来说，水凝胶建有类似于亲水物质和疏水物质的特点。

1.2.2水凝胶的分类

水凝胶的种类很多，其分类的依据有：材料的来源、交联方式、交联结构等^[2]。

分支众多的水凝胶，从来源来说，有天然、合成以及半合成三大分支。就天然类来说，其原料取自于自然，可以从自然界中的动植物获取，如壳聚糖、纤维素。同时，因为是来源丰富的自然材料，则天然水凝胶相对合成水凝胶更加容易降解、毒性更低且可再生，而其缺点则是力学性能弱、批次重复性差、同样性能的水凝胶难以大量获取。第二类的水凝胶是经由化学反应使线性高分子交联而来的。这类水凝胶可以说是“无中生有“，即用自然界不存在的或很少的物质来合成水凝胶。虽然原材料不够多，但是正因为是人造的，它的各项性能不是始终一成不变的的，人们可以通过修改反映参数、改变结构等来适应不同需求，而且同种水凝胶可以大批量制造，其不足则是缺少细胞识别的信号，对于细胞的亲和力很差。第三种水凝胶则是由天然水凝胶的原料和合成水凝胶的原料混合在一起使用制备得来的，这样可以改善单独使用一种水凝胶时的弊处，可以通过各种配合来满足人们的不同需求。

在水凝胶的各分支中，交联方式又具有两个完全迥异的分支，即物理方式和化学方式。前者形成水凝胶结构的完全是靠高分子链之间的氢键等作用维持的，正因为这样，这类水凝胶的结构并不稳定，就如同几何图形中的四边形一样，一旦受到外界的刺激，就可能变形甚至分解。尽管与化学交联相比没有那么稳定，但足以维持其基本的溶胀性。而水凝胶通过第二种方式交联而成后，就像是几何图形中的三角形，结构稳定，承受得住大部分来自外界的各种刺激。

外界刺激对于不同水凝胶进行刺激，而水凝胶是否有反应及反应的快慢便可作为一个分类依据，即传统水凝胶和智能水凝胶。所谓的传统水凝胶是指上述对于刺激毫无反应的各种水凝胶，而智能水凝胶顾名思义是对于外界环境条件的微小变化都十分敏感，能够很迅速地分辨出环境的变化，这个特性使它在生物、医药以及组织工程中都得到了广泛的应用。不同智能水凝胶对于不同变化的敏感程度不同，有的对温度变化很敏感，即为温度智能水凝胶，还有的对磁场、电场等变化的反应很敏锐。

1.2.3水凝胶的制备方法

水凝胶的制备方法有很多种，其中使用最多的就是化学交联、物理交联以及辐射交联这三种方法^[3]。

使用化学交联法时，反应单体、反应条件以及交联剂略微改变都是会影响水凝胶的性能。而化学交联法中最常使用的途径有两类。一类是在交联剂存在的情况下，至少一种以上的低分子类单体直接进行聚合反应，即聚合反应交联；另一类是将原本没有聚合反应活性的聚合物改性使之成为含有聚合基团的衍生物，然后再进行交联。此种方法与人们的需求更加相符，能够引入人们所需的基因并且能够调节水凝胶的官能团密度以及交联程度。而一般来说，多余交联剂对于水凝胶影响较大，因此想方设法除去未反应的交联剂是非常有必要的。使用物理交联法时，主要依靠分子间的氢键等非共价键作用维持水凝胶的结构。正因如此，结构比较容易受外界影响而改变，但是使用这种方法能够避免使用交联剂，因此这类水凝胶相比于化学交联法制备的水凝胶毒性更低且易降解，更加广泛的用于药学和生物医学中。另一方面，因为这类水凝胶是通过物理作用制备的，所以它的机械性能很差且容易溶解。

辐射交联法则是运用高能辐射使单体之间产生活性粒子进而发生聚合反应交联而产生水凝胶。这种方法的优缺点很明显，优点是没有用到交联剂和引发剂，得到纯度更高的水凝胶，且反应条件更简单，即在常温常压下进行，综上所述可概括为操作简便，所得产物纯度高且毒性低。鉴于这点，辐射交联法在近年来得到人们的亲睐，被广泛使用。

1.2.4水凝胶在医用领域的应用

医用敷料是用于一种用来覆盖创面的医用制品。在过去，医用敷料的功用仅限于清洁并保护伤口的作用，如常用的纱布和棉垫等，而在医疗科技高速发展的今天，医用敷料已经不仅仅只有当初的基础功能了。如今，它不仅可以清洁所覆盖的创面，还可以吸收体内渗出液，甚至促进伤口的愈合。

虽然传统的敷料如纱布、脱脂棉等可以对伤口表面有保护作用，但是它们的透水透气、组织细菌接触、促进伤口的愈合等性能已经不能满足目前对于医用敷料的要求了。传统的敷料在吸收积液方面表现很差，所以经常要多覆盖很多层才能保证积液被吸收，除此之外，传统敷料往往会与伤口粘结，造成二次伤害。

而水凝胶首次被用于覆盖体表创伤追溯到二十世纪七十年代。水凝胶是一种由水溶性高分子制成的果冻状物体。它的吸水能力很强，能够吸收自身质量成百倍上千倍的水，并保持其水分不溢出同时水凝胶是透明的，对于观察创面的情况更加方便，不像传统敷料那样需要拆掉包扎才能观察，那样不仅步骤繁琐，而且容易导致伤口接触细菌从而引发伤口感染^[4]。且水凝胶作为医用敷料时，不会与伤口粘结，操作简便，不会给病人带来较大痛苦。除此之外，有的水凝胶还具有释放抑制细菌生长的物质的功能，能够避免感染，促进伤口加快愈合。

1.3壳聚糖及其衍生物的概述

1.3.1壳聚糖的概述

壳聚糖并非天然动物来源，通常是由用碱性溶液脱乙酰化甲壳素而来的。第一个有具体记载的是法国的植物园主任兼南溪科学院成员，布拉克诺特教授在1811年将一些高等真菌的分离物中的耐碱性部分命名为真菌素。接着，1823年，奥迪耶发现了一种与真菌素具有相同一般特性的物质甲虫的表皮。他将这种材料命名为“甲壳素”，源于希腊语“chiton”指的是“盔甲”的角质层。随后，在二十世纪的上半部分，迈耶等人对甲壳素相继进行了衍射、酶解和脱氨化学反应，由此甲壳素的化学结构完全被人们确定，甲壳素开始被阐明并使用。1859年的壳聚糖的发现则要归功于Rouget，在一次偶然的实验中，甲壳素经过KOH溶液煮沸后，其溶解性有所改善，开始能够溶于有机酸^[5]。而壳聚糖获得这个命名是在1894年，Hoppe Seyler把这种物质成为壳聚糖。但是，限于科技的发展，直到1950年，壳聚糖的结构才被人们分析确定。现在，在生物医药领域，壳聚糖的使用愈发普遍，即开发应用壳聚糖的步伐在不断加快。壳聚糖在大自然中十分丰富，可以从各种生物上获取，尤其是甲壳类动物，它们的甲壳就能提取出较多壳聚糖，况且在食品工业中，使用甲壳动物的甲壳更加经济。通常壳聚糖的加工步骤包括脱蛋白、脱甲基化、脱色和脱乙酰化：

甲科类动物甲壳→粉碎甲壳→蛋白质分离→加入NaOH→用HCL洗涤去矿化→洗涤和脱水→脱色→获得甲壳素→用NaOH溶液去乙酰化→洗涤和脱水→得到壳聚糖

壳聚糖因为其优良特性在骨组织工程中发挥了巨大的作用，如其生物相容性、抗菌性和促进伤口愈合的特性对于组织工程具有很大的意义。其中，许多壳聚糖基支架被用于骨再生，包括海绵、水凝胶等材料。

除了低成本，壳聚糖还表现出优秀的生物相容性、抗菌效果以及与骨和软骨糖蛋白的相似性。此外，研究表明壳聚糖分子中含有较多胺基，而这些胺基作为亲核物质在生物接合技术中使壳聚糖更易于改性。胺基的质子化作用使壳聚糖具有亲水性得以溶解于水中，但同时胺基的质子化需要一种远远低于生理酸碱度的水溶液（PH接近5）

壳聚糖是一种线性多糖，具有随机分布的特点。对（L-4）键D-葡萄糖胺（去乙酰化单元）和N-乙酰-D-葡萄糖胺（乙酰化单元）通常来源于甲壳素^[6]。

壳聚糖拥有许多突出的性能如结构稳定性、生物相容性、生物降解性、无毒、可回收利用等，是一种经济实用的天然聚合材料，已经被广泛生产。在总产量方面，甲壳素则是仅次于纤维素的第二大天然多聚体。因此，人们对于壳聚糖的研究从未间断，同时从理论研究向对材料改性方面转变^[7]。

壳聚糖在固体状态下是白色或浅灰色的半结晶聚合物，与其他多糖（纤维素）类似，壳聚糖的重复单元通过P（L-4）键连接。独特的双螺旋结构是壳聚糖分子链所形成的空间结构。而基本单元中含有大量的羟基、N-酰胺基团或氨基。同时形成的这类氢键具有较高的链规整性，使得壳聚糖形成了半结晶结构。壳聚糖的晶体结构还无法全部确定。在以低分子量的壳聚糖为原料经完全脱乙酰化所得的壳聚糖单晶中，人们已经发现各种类型的晶体，他们主要分为三种类型：α,β,γ, 其中α型是由两个反向平行链形成的，而β型是由两条平行链排列形成，γ型由两条平行链和一条反向平行链排列形成的。在不同的条件下，三种类型是可以相互转换的。原料来源、处理方法和实验条件的差异都会使壳聚糖单元细胞的参数发生较大的变化，且无明显规律。壳聚糖的结晶度在很大程度上取决于其结构成分，通常是纯甲壳素（脱乙酰度，DD，为0）和纯壳聚糖（DD为100%）具有较高的规律性，因此结晶度较高。甲壳素的脱乙酰化操作降低了结晶度的等级和弱化了结晶的规律，然而，随着DD的增加，分子链开始再次均匀化，使结晶度又升高。

1.3.2羧丁酰壳聚糖的概述

虽然壳聚糖具有良好的生物相容性、生物粘附性，原料来源丰富以及应用广泛，但是壳聚糖不溶于水与有机溶剂的特性使得对于壳聚糖的应用有很大的阻碍^[8]。同时，壳聚糖分子链上含有的大量活性基因，这使壳聚糖很容易改性使它的溶解性有所改变，更方便壳聚糖的应用。

作为一种新型的壳聚糖衍生物，羧丁酰壳聚糖具有非常大的开发潜力。壳聚糖上的氨基与丁二酸酐反应形成酰胺键，从而具有亲水性的羧基，羧基与剩余的氨基使得羧丁酰壳聚糖具有良好的溶解性。且羧丁酰壳聚糖相较于壳聚糖，能够溶于水，并且在人体能够滞留相当长的时间，除此之外，分子上含有较多羧基与氨基，能够与很多种药物结合，所以能够作为很好的药物载体^[9]。羧丁酰壳聚糖在抗癌药物载体、药物释放以及基因领域方面有很大的发展前景。

1.4胶原蛋白肽的概述

胶原蛋白是构成组织细胞外基质的主要蛋白质。在体内（皮肤、软骨、血管…）。它含有多种胶原蛋白，这项工作只研究纤维状胶原（例如皮肤中含有的I型胶原），显示由3个α-螺旋胶原链组成的三重螺旋结构^[10]。这个特别的和定义的层次结构对于胶原蛋白。将胶原蛋白加工成支架来模拟ECM对于成功组织工程。近年来，胶原被加工成纤维状多孔支架。采用静电纺丝工艺。胶原作为纤维网络存在，并提供结构完整性。以及适应细胞生长和组织发育的延展性。哺乳动物许多软结缔组织中的大部分（约80%-90%）由I型纤维胶原组成。尤其是胶原蛋白家族中至少有28个已知成员。所有胶原都有一个共同的结构α-螺旋基序。胶原蛋白具有独特的三螺旋结构，而维持三螺旋结构的基本功能和结构则需要大量的甘氨酸，因此，胶原蛋白中每三个氨基酸中就有一个甘氨酸，胶原分子的长度约为300纳米,被组织为三螺旋(两条A1链和一条A2链)。具体来说定位于每三个残基，使其R基（氢原子）的方向朝向螺旋的中心，从而实现紧密的螺旋包装。胶原可根据其结构分为不同的组。I型、II型、III型、V型和XI构成了"纤维状胶原"组,而非纤维状胶原组由几个亚类组成。Facit(纤维相关胶原与间断三螺旋)胶原包括类型IX、XII、XIV、XVI、XIX、XX和XXI^[11]。"短链"胶原包括类型VIII和X。VII型胶原，另一种形成网状的胶原，在皮肤、口腔粘膜和表皮-真皮连接处特别丰富，并聚集成二聚体形成。“锚定纤维”。这些在将基底层附着到下面的结缔组织上特别重要。还有跨膜胶原（类型XIII、XV、XVII、XXIII和XXV），形成独特的结构。虽然大多数胶原的主要功能是作为结缔组织的结构支撑，但胶原也作为其他ECM蛋白质如纤维连接蛋白的结合伙伴。

胶原蛋白肽是胶原蛋白加入蛋白分解酶并进行部分加水分解而获得的产物。胶原蛋白肽具有很多优点，如相对分子质量小、良好的生物相容性以及可降解性等，此外，胶原蛋白肽经过修饰后就更加适用于生物医学领域^[12]。