摘 要

传统的酸性矿山废水治理方法存在运行成本高、经济效益低等缺点，而新兴的微生物治理法，利用硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria, SRB)处理AMD，适用于无人监管的野外环境，运行成本低，无二次污染，目前已成为研究的热点。

相较于小分子速效碳源，缓释碳源一次补充即可长期使用，大大延长了维护周期，降低了维护成本，具有实际应用价值。土豆是我国重要的经济作物之一，在我国大部分地区均可种植且产量巨大、价格低廉，在作为SRB缓释碳源方面拥有天然优势。本研究以土豆为缓释碳源负载SRB处理模拟酸性矿山废水，研究内容与主要成果如下：

(1) 从校园土壤中富集筛选并保存SRB的菌种，并对其进行了活性测定，该菌株在以土豆为碳源的培养基中培养96h后OD₆₀₀达到0.7144，培养基的最终pH为6.5，在86h时达到最低ORP值-310mV。在以乳酸钠为碳源的培养基中培养96h后OD₆₀₀达到0.3157，培养基的最终pH为6.4，在86h时达到最低ORP值-289mV。

(2)本研究对所得菌株进行了以除镉效果的为考察目标的单因素优化实验。通过单因素实验得到该硫酸盐还原菌菌株处理模拟酸性矿山废水的最优条件为：pH为6.0、培养温度为35°C，土豆用量为5g/200mL培养基，在该参数条件下培养的SRB比在普通条件下培养的SRB有更强的除镉能力。

(3)本研究对考察了以土豆为碳源培养的SRB对不同镉含量的模拟酸性废水的处理能力，当镉含量为0.025mg/mL液体培养基时，镉离子去除率最高，达到89.67%，同时硫酸根还原率也最高，达到55.33%。

关键词：土豆；缓释碳源；硫酸盐还原菌；酸性矿山废水；镉

Abstract

Traditional methods of acid mine wastewater treatment have the disadvantages of high operation cost and low economic benefit. However, the emerging microbial treatment method, using sulfate-reducing bacteria (SRB) to treat AMD, is suitable for unregulated field environment with low operation cost and no secondary pollution. It has become a research hotspot.

Compared with the small molecule quick-acting carbon source, the slow-release carbon source can be used for a long time by one replenishment, which greatly prolongs the maintenance cycle, reduces the maintenance cost and has practical application value. Potato is one of the most important cash crops in China. Potato can be planted in most areas of China with huge yield and low price. It has natural advantages as a slow-release carbon source of SRB. In this study, potatoes were used as slow-release carbon source to load SRB to treat simulated acid mine wastewater. The research contents and main results are as follows:

(1) The strain of SRB was enriched, screened and preserved from campus soil, and its activity was determined. The OD₆₀₀ of SRB reached 0.7144 and the final pH of culture medium reached 6.5 after 96 hours of incubation in potato-based carbon source medium. The ORP value of SRB reached the lowest value - 310mV at 86 hours. The OD600 reached 0.3157 after 96 hours of incubation in the medium with lactic acid as carbon source, the final pH of the medium was 6.4, and the lowest ORP value was - 289 mV at 86 hours.

(2) In this study, single-factor optimization experiments were carried out to investigate the effect of cadmium removal. The optimum conditions for treating simulated acid mine wastewater by SRB strain were as follows: pH 6.0, incubation temperature 35 C, potato dosage 5 g/200 mL. SRB cultured under this condition had stronger cadmium removal ability than SRB cultured under ordinary conditions.

(3) In this study, the ability of SRB cultured with potatoes as carbon source to treat simulated acid wastewater with different cadmium content was investigated. When the cadmium content was 0.025 mg/ mL liquid medium, the removal rate of cadmium ion was the highest, reaching 89.67%, and the reduction rate of sulfate was the highest, reaching 55.33%.

Keywords: potato; slow-release carbon source; sulfate reducing bacteria; acid mine wastewater; cadmium

目 录

摘 要 I

Abstract II

第1章 绪论 1

1.1 酸性矿山废水污染现状

1.2 酸性矿山废水中镉污染危害 1

1.3 酸性矿山废水治理研究进展 2

1.3.1 传统酸性矿山废水治理技术 2

1.3.2 新兴酸性矿山废水治理技术 2

1.4 微生物技术治理酸性矿山废水研究进展 3

1.5 硫酸盐还原菌治理酸性矿山废水原理 3

1.6.1 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 4

1.6.1 研究课题的目的及意义 4

1.6.2 研究课题的主要内容及技术路线 5

第2章 硫酸盐还原菌株的筛选、培养及其活性研究 6

2.1 引言 6

2.2 实验材料与方法 6

2.2.1 实验仪器及试剂 6

2.2.2 菌源选取 6

2.2.3 实验方法 6

2.3 结果与讨论 10

2.3.1 SRB菌株的筛选、分离与保存 10

2.3.2 菌株生长曲线的研究 11

2.4 本章小结 13

第3章 硫酸盐还原菌生长条件优化 15

3.1 引言 15

3.2 实验材料及方法 15

3.2.1 实验仪器及试剂 15

3.2.2 镉离子标准曲线的测定 16

3.2.3 硫酸根离子标准曲线的测定 17

3.2.4 以土豆用量为变量设计梯度实验 17

3.2.5 以培养温度为变量设计梯度实验 18

3.2.6 以液体培养基pH值为变量设计梯度实验 18

3.2.7 最优培养条件下SRB的生长情况及除镉能力检测 18

3.3 结果与讨论 18

3.3.1 不同土豆用量对SRB生长及除镉能力的影响 18

3.3.2 不同温度对SRB生长及除镉能力的影响 19

3.3.3 不同培养pH值对SRB生长及除镉能力的影响 20

3.3.4 最优培养条件下SRB的生长情况及除镉能力检测 22

3.4 本章小结 23

第4章 以土豆为碳源负载SRB对Cd² 成矿能力探究 24

4.1 引言 24

4.2 实验方法 24

4.2.1 SRB的矿化实验 24

4.2.2 矿化产物的分析表征 24

4.3 结果与讨论 24

4.3.1 SRB菌株矿化能力检测 24

4.3.2 矿化产物的结晶形貌及组成分析 26

4.4 本章小结 27

第5章 硫酸盐还原菌处理模拟AMD的应用研究 28

5.1 引言 28

5.2 实验材料及方法 28

5.2.1 培养基的配置 28

5.2.2 以镉离子浓度为变量设计梯度实验 28

5.3 结果与讨论 28

5.4 本章小结 30

第6章 结论与存在问题 31

6.1 结论 31

6.2 本研究存在的问题 31

参考文献 32

致 谢 34

第1章 绪论

1.1 酸性矿山废水污染现状

水是生命之源，淡水资源短缺是威胁人类生存最重要的原因之一。随着工业的发展，水体污染使淡水资源短缺的形势更加严峻。而在形式众多的水体污染中，酸性矿山废水造成的危害不容小觑。

酸性矿山废水（acid mine drainage，AMD）是指矿山因开采或自然风化而产生的含有大量重金属离子的酸性废水。AMD的主要成因有3 种^[1]：①在开采金属硫化矿床的过程中因自然降雨或地下水渗漏而发生矿物淋溶，下渗到工作面的雨水或地下水溶解了大量重金属离子和硫酸根离子，形成酸性废水被排出坑外。 ②矿物开采过程中产生的硫化废石，未被妥善处理而弃置在露天环境中被空气氧化，因降雨而形成大量酸性废水。 ③因矿物加工而产生的洗矿、选矿水等。

据统计，我国各大矿区在采矿和选矿作业时产生的废水量高达12～15 亿吨，占有色金属工业废水总量的十分之三^[2]。酸性矿山废水因其低pH值和高重金属浓度，对自然水体的生态环境造成极大破坏。同时重金属离子对生物体有一定的毒害作用，会通过食物链传递和富集，危害人类健康^[3]。

1.2 酸性矿山废水中镉污染危害

酸性矿山废水含有的重金属多种多样，这些重金属离子对动植物有毒害作用，而镉离子的危害尤甚。

镉离子对植物的危害表现在受镉毒害的植物生物量下降，不能正常生长。根据孔祥生等人的研究^[4] ，玉米受到镉毒害后出现生长迟缓、叶尖黄褐、根尖膨胀发黑甚至腐烂的症状。其他植物受到镉毒害后表现的症状与玉米相似^[5-7]。由此可见镉污染会引起农作物减产，同时危害会通过食物链转嫁到人类身上。

镉离子对人和动物的危害表现在：①镉能使许多酶活性受到抑制，从而影响器官的正常功能。 ②镉会毒害肾小管，造成肾功能不全，导致糖尿、蛋白尿、氨基酸尿等症状，最终导致肾的病理变化。 ③镉会使尿钙和尿酸的排出量增加，同时影响维生素D的吸收，引发钙和磷的代谢异常，诱发骨质疏松、骨软化和肾结石等疾病，最终引发“骨痛病”。 ④镉对哺乳动物的胚胎具有较强的致畸作用。 ⑤镉会降低胚胎移植的成活率，导致超排卵的数目减少^[8]，或抑制卵母细胞的减数分裂过程，降低卵母细胞的受精能力和存活率。因此镉会导致育龄妇女的生育能力下降甚至不孕不育^[9]。⑥镉进入人体后通过血液循环遍及全身。镉离子一般很难穿过血脑屏障，如若穿过极易引起大脑中毒，导致死亡 ^[10]。

1.3 酸性矿山废水治理研究进展

1.3.1 传统酸性矿山废水治理技术

（1）中和法：在废水中投入大量的碱性物质以提高体系的pH值，使得废水中的金属离子和氢氧根反应生成难溶的氢氧化物，将金属以沉淀的形式去除。该方法高效便捷。技术难度低，但是消耗化学药剂较多，同时会产生大量的废渣，处理成本高，易造成二次污染。但中和法目前仍然是处理矿山酸性废水最常用的方法^[11]。

（2）硫化物沉淀法：与中和法类似，在废水中投入过量硫化剂，使得金属离子与硫离子生成难溶的金属硫化物沉淀，从而被去除。因为金属硫化物比其氢氧化物的溶解度更低，因此该方法去除重金属的效果比中和法更好，并且金属硫化物可以作为资源回收。但硫化剂的价格昂贵，并且在处理过程中易产生有害的H₂S气体，因此此法的应用受到了限制。

（3）人工湿地法：在人工或天然形成的基质上栽种可固定、降解重金属的植物，构建人工湿地。当酸性矿山废水流经这些人工湿地时，其中的金属离子可被植物吸收。同时，湿地中的微生物群落能对重金属离子起到一定的矿化作用，而人工湿地的基质也能对酸性的水质起到一定的中和作用。目前，我国采用构建人工湿地的方法处理酸性矿山废水的实例还比较少。根据唐述虞等^[12]在20世纪90年代的研究表明，在人工湿地的作用下，废水的pH值缓慢升高到6时，铁离子的去除率几乎达到100%。

1.3.2 新兴酸性矿山废水治理技术

（1）吸附絮凝法：利用高分子聚合物和金属离子间的吸附、聚沉作用，使得金属离子絮凝从而被去除，同时改善酸性的水质。目前天然高分子在处理酸性矿山废水方面的应用逐渐受到人们的关注。根据陈夕^[13]的研究，壳聚糖作为吸附剂能够很好地去除废水中金属离子，同时提高体系的碱性。

（2）微生物法：利用微生物能直接利用某些金属离子或使重金属离子矿化的能力处理AMD。微生物可自我繁殖，该方法适用于无人监管的野外环境，运行成本低，无二次污染，发展潜力巨大，目前已成为研究的热点。

1.4 微生物技术治理酸性矿山废水研究进展

微生物治理法可大致分为细菌修复和真菌修复两类。某些细菌的胞体带有负电荷因而能够吸引游离的金属阳离子，同时细胞表面的阴离子能与重金属离子发生吸附络合作用，从而起到了良好的去除重金属的效果。Ziagova^[14]等的研究证明，假单胞菌对镉离子的吸附量最高可达到278 mg/g；陈佳亮^[15]等在电子废弃物污染的

土壤中富集筛选了4种耐性细菌，其中一株菌对Cd² 的最大吸附率达94.2%。此外某些细菌的代谢产物可与重金属离子产生沉淀从而达到去除重金属的目的，例如硫酸盐还原菌代谢产生的H₂S能与重金属离子形成金属硫化物沉淀。

实验室采用乳酸钠、酒精废液等小分子物质作为SRB速效碳源处理模拟AMD已有较好的效果，但速效碳源存在需要频繁补充的缺点。由于矿区偏远，速效碳源不适用于矿山关闭后疏于管理甚至无人管理的情况。而缓释碳源一次补充即可长期使用，大大延长了维护周期，降低了维护成本，具有实际应用价值。土豆是我国重要的经济作物之一，在我国大部分地区均可种植且产量巨大、价格低廉，在作为SRB缓释碳源方面拥有天然优势。

真菌修复，主要是通过吸附和转化的作用去除重金属。吸附作用的原理是真菌细胞壁的多孔结构和活性配位体能够与金属离子相结合，同时胞壁上的糖蛋白能一定量的重金属离子发生络合反应^[16]。转化作用的原理是通过真菌的氧化还原和甲基化反应去除重金属离子。

1.5硫酸盐还原菌治理酸性矿山废水原理

（1）硫酸盐还原菌在代谢过程中，利用有机物还原SO₄^2-，生成H₂S和HCO^3-。碳酸氢根进一步与酸性废水中的氢离子结合，生成水和二氧化碳，从而使体系的pH提高。

HCO₃^- H →H₂O CO₂ SO₄^2- CH₂O→H₂S 2HCO₃^-

（2）体系的pH提高后，废水中的Al³ 、Fe³ 等三价的金属离子会以氢氧化物沉淀的形式被去除。

（3）硫酸盐还原菌代谢过程中产生的二氧化碳溶于水可能生成CO₃^2-，有些游离的金属离子，例如Mn² ，就以碳酸盐沉淀的形式被去除。

（4）硫酸盐还原菌代谢过程中产生的H₂S溶于水后生成S^2-，例如Cd² 等的重金属离子就会以硫化物的形式沉淀下来。

（5）硫酸盐还原菌在代谢过程中会分泌一种含有氨基、羧基、羟基等阴离子基团的具有黏性的胞外聚合物。这种胞外聚合物会与金属离子发生吸附和螯合，从而达到去除重金属离子的目的^[17]。

1.6研究目标、研究内容和拟解决的关键问题

1.6.1研究课题的目的及意义

我国采矿作业产生的酸性矿山废水总量巨大，对矿区效益和环境造成了极大的压力。同时矿山多位于山区河流上游，在天然降水的补给下会形成含重金属离子的矿山淋滤水，水中含有大量的镉、铅、锌、铜等重金属离子，若不妥善处理会对下游地区的人和水中生物造成极大的危害。此外酸性矿山废水pH值一般在2~4，一旦排入矿山附近的河流、湖泊，会导致水体的pH发生变化，抑制或阻止细菌及微生物的生长，妨碍水体的自净。同时重金属在水体中可以通过悬浮物的沉淀、吸附或离子交换作用进入次生矿物相，进而污染地表及地下水水体、地表土壤，使周边生态环境遭受严重的破坏。

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