摘 要

细菌纤维素是一种微生物合成的纤维，具有良好的生物相容性，但是其在体内不可降解，且不具备导电性能。目前国内外已有PPy/BC复合材料的合成工艺，但由于未解决其在体内的自然降解过程而使其应用收到极大的限制。本文主要研究了细菌纤维素（BC）通过高碘酸钠氧化处理破坏BC分子内部的β-1,4葡萄糖键使得原本的BC具有在人体内自然降解的能力，再通过化学氧化法与聚吡咯（PPy）聚合以增强其导电性，使BC具有导电能力。研究结果表明：通过高碘酸钠氧化处理后的BC具有良好的自然降解能力，在生理pH值（7.4左右）可以在28天内降解21.0±2.6%（纯BC仅能降解1.44±0.37%）；且制得的PPy/BC复合材料具有良好的细胞相容性（MTT法测试相对增殖率达94%）和较高电导率（可达0.748±0.115 S/cm）。PPy/BC复合材料材料制造工艺成本低廉，细胞毒性较低，在修复受损人体神经纤维应用方面具有良好前景。

关键词：细菌纤维素；聚吡咯；可降解；导电聚合物

Abstract

Bacterial cellulose is a microbial synthetic fiber with good biocompatibility, but it is not degradable in the body and does not have electrical conductivity. At present, there are synthetic processes for PPy/BC composite materials at home and abroad, but their application has been greatly limited due to the unresolved natural degradation process in the body. The paper mainly studies the ability of bacterial cellulose (BC) to destroy the β-1,4 glucose bond inside the BC molecule by sodium periodate oxidation treatment, so that the original BC has the ability to naturally degrade in the human body. Then polymerization with polypyrrole (PPy) by chemical oxidation to enhance its conductivity and make BC conductive. Since both materials are relatively easy to obtain, low in cost, and non-cytotoxic, they have good prospects for applications such as repairing damaged nerve fibers. The results showed that the BC treated by sodium periodate had good natural degradation ability, and the physiological pH value (about 7.4) could be degraded by 21.0±2.6% in 28 days (pure BC can only degrade 1.44±0.37%); PPy/BC composites have good cytocompatibility (testing proliferation rate of 94% by MTT method) and high conductivity (up to 0.748±0.115 S/cm).

Key Words：Bacterial cellulose；Polypyrrole；Degradable；Conductive polymer

目 录

第1章 绪论 1

1.1 研究背景 1

1.2 细菌纤维素的优势 1

1.3 细菌纤维素的降解处理 2

1.4 提升细菌纤维素的导电能力 3

1.5 研究目的 4

第2章 实验部分 5

2.1 实验仪器与试剂 5

2.2 PPy/BC复合材料的制备 6

2.2.1 BC膜的培养 6

2.2.2 BC膜的预处理 7

2.2.3 BC的冻干处理 8

2.2.4 BC的氧化处理 8

2.2.5 BC与PPy的结合处理 9

2.3 PPy/BC复合材料的表征方法 10

2.4 溶胀能力评价 10

2.5 细胞毒性评价 11

2.6 降解能力评价 12

第3章 结果与讨论 13

3.1 傅里叶红外光谱分析（FT-IR） 13

3.2 拉伸性能 14

3.3 电导率性能 15

3.4 溶胀吸水性能 15

3.5 细胞毒性 17

3.6 降解能力 18

第4章 小结 19

参考文献 20

致谢 24

绪论

1.1 研究背景

现代医学的发展，在一定程度上改善了人们的生活质量，也延长了人类的平均寿命，可以使人们在遇到严重身体伤害的时候能接受良好的治疗并最大程度上恢复至健康状态。在生物医学领域，血管、骨骼和常规内脏的损伤修复已经取得较大的进展，人们可以利用身体内部的其他组织替代受损的组织或者器官，且效果良好。但是，神经系统受损依然是一个很严重的医学问题，众多患者因为严重的神经损伤导致生活不便，例如瘫痪等严重的后遗症。

人体的神经系统在受到较低程度的损伤后可以在一段时间内自行恢复，但在大量受损的情况下，依然需要移植神经纤维来修补神经的缺损。以目前的生物医学技术来说，神经的自体移植是最优的解决方法，可以在最大程度上恢复原有的神经结构和功能。但是，其缺点却十分明显，比如说仅可用于小规模的修复、缺乏可用的供体神经、需要二次手术、供体神经原有功能的永久性缺失和潜在的大小错配^[1,2]。而异体移植物容易引发免疫排斥反应^[3]，因为外部移植的材料不论是生物材料还是合成材料都可能因为无法被体内的免疫系统识别而使免疫细胞攻击自身组织细胞，严重者可能会出现生命危险。而且对于许多的生物材料可能会因为聚合物单体有毒性或者对身体内某器官不利，而高聚物无毒，在体内降解后不能及时排出体外或者无法被人体免疫系统安全清除，都会对身体健康造成不利影响。所以对于异体移植物要有如下几个特征：无细胞毒性，较好的细胞相性，足够的抗拉伸强度，以及适当的降解速度。目前天然的生物材料主要有胶原蛋白^[4]、壳聚糖^[5]、藻酸盐^[6]、明胶^[7]、丝素蛋白^[8]等；合成的生物材料主要有聚（L-丙交酯- coglycolide）（PLGA）^[9]，聚（乙醇酸）（PGA）^[10]，聚（E-己内酯）（PCL）^[11]，聚（3-羟基丁酸酯）（PHB）^[12]等及其衍生物或复合物可以用于重建神经导管^[13-15]。然而，很少有材料作为人工神经导管时可以达到自体神经移植的恢复能力和实际使用效果，例如PLGA降解会产生乳酸和羟基乙酸，乳糖缺陷者不能使用^[9]；PGA和PHB无多孔结构，主要应用于可降解塑料手术缝合线，不适合与导电聚合物进行复合^[10,12]；因此，需要克服多数合成生物材料所具有的缺陷开发新的、用于神经导管恢复的生物复合材料。

1.2 细菌纤维素的优势

细菌纤维素（BC）是一种由特定微生物细菌体外产生的多糖，具有多孔的纳米结构特征，例如极高的亲水性、高拉伸强度等^[16,17]，同时拥有非常好的细胞相容性，无细胞毒性。BC最早因为发现于1973年，之后因为其发现于椰汁加工中的副产物，广泛应用于食品工业，俗称“椰果”。1976年，布朗（R. M. Brown）及其合作者首次描述了纤维素生物合成过程中醋酸菌的运动。25℃下细胞在合成和分泌纤维素微纤维时的移动速率为2.0微米/分，相当于每个细菌每小时把108个葡聚糖分子连接到D-葡聚糖链上。相比于植物的纤维素来说，细菌纤维素中不含有木质素、果胶和半纤维素等伴生产物，具有高纯度、高聚合度（高达2000~8000），且弹性模量高，持水能力强，未干燥的BC持水能力可达1000%以上，冷冻干燥后也可以达到600%以上，同时拥有较高的生物相容性，在自然界中可以依靠酸性或者微生物自然降解。所以BC已经广泛应用于伤口敷料^[18]、人造皮肤^[19,20]、人造血管^[21,22]、人造软骨等场合^[23]。介于以上性质和用途，这种生物材料同样也可能适合于修复人体受损神经。

Kowalska-Ludwicka等人报道纤维素神经管具有良好的生物相容性^[24]，并允许神经营养因子在内部积聚。Zhu等人证明柬埔寨合成的细菌纤维素（KBC）导管与原代培养的雪旺细胞（SCs）具有良好的生物相容性，并且不会对体内神经组织造成血液学和组织学毒性作用^[25]。所以使用细菌纤维素作为复合材料的载体是非常合适的，也具有安全性。

1.3 细菌纤维素的降解处理

然而对于纤维素这种多糖类物质来说，人类不仅不能通过消化系统进行消化，在体液环境中也缺少对应的酶或者化学过程可以使其降解。如果需要降解细菌纤维素，则需要破坏β-1，4糖苷键^[26]，这是目前将细菌纤维素应用在体内作为组织支架的主要障碍。通常来说，可以使用外部手段来通过各种化学药品，除了使用对应的水解酶以外，也可以用高碘酸盐、次氯酸盐、重铬酸盐、二氧化氮等氧化剂来氧化纤维素中的葡萄糖单体来实现纤维素的降解过程^[27-29]。Peng等人通过在二氧化氮（NO₂）存在下氧化BC制备可降解的OBC，但氧化过程耗时长达12天^[27]，其漫长的氧化处理过程不利于实际大规模生产和应用，且研究中未研究OBC的机械性能和生物相容性，最重要的细胞毒性同样未知。其他方法也可以用于改善BC的生物降解性，Wang等人报道了一种具有理想生物降解速率的可生物降解纤维素酶/BC材料，然而需要使用在中性/碱性环境下，酸性或杂化纤维素酶的BC在pH值大于6时几乎不能表现出良好的降解性^[28]。此外，如果纤维素酶不能保存在最优pH值环境下，其活性会降低至少90%，从而失去良好的降解能力^[30]。

在本研究中，使用高碘酸盐氧化的目的是在没有明显的副反应情况下将1,2-二羟基转化为二醛^[31]，使其可以进入人体正常的新陈代谢环节，从而可以在不影响人体正常身体健康的情况下实现自然降解。其过程为：高碘酸根的氧化性作用于1，4-葡聚糖时切割分子上C2-C3的化学键，然后将吡喃葡萄糖环和所得的羟基进一步氧化成二醛基团。据报道，含二醛的纤维素可以在生理条件下可通过水解反应达到降解的效果^[29,32]。Singh等人证明高碘酸盐氧化纤维素（OBC）可以在体内和体外的生理pH下降解为乙醇和2,4-二羟基丁酸^[32]，乙醇在尿液中排泄或进入三羧酸循环，2,4-二羟基丁酸酸参与肝脏中L-高丝氨酸的代谢^[33]。在Hou等人的研究中证明使用0.05mol/L的高碘酸钠处理细菌纤维素3h情况下具有最低的细胞毒性和细胞相容性^[34]，故本研究使用该反应条件制备可降解的氧化细菌纤维素（OBC）后使用吡咯处理得到具有导电性的PPy/BC复合材料。

1.4 提升细菌纤维素的导电能力

但是，人体内的信息交流主要通过两种途径，一是内分泌调节，使用激素控制各器官之间的协调，二是神经通信和神经调节，主要是神经元通过电信号在神经纤维上传递信息，具有速度快，准确性高的特点，也是身体内主要的通信方式。在我们身体中，神经系统是最大的电活性基础结构，其次是心脏和其他肌肉。前者用于通过突触将信息从神经元传递到神经元，而心脏的肌肉细胞产生电脉冲，传导到器官的每一个细胞，从而导致肌肉收缩，因此产生有节奏的心跳。另外，几个研究已经表明有些组织，比如骨髓，使用导电生物材料可以刺激新组织的再生。因此，与用于生物医学领域的电活性组织相接触的材料也必须是导电的，以增强对外部刺激的生物反应。虽然制得的OBC具有可以在体内自然降解的能力，但是其导电性微乎其微，电导率接近于绝缘体，不足以用于传导神经系统的电信号，所以需要寻找一种具有导电能力的有机聚合物与之结合形成导电聚合物（CP），增强其导电能力。聚吡咯（PPy），聚苯胺（PANI）和聚（3,4-乙基-烯二氧噻吩）（PEDOT）是迄今为止生物医学领域中使用最多的CP，并且是用于开发导电3D结构的唯一用途。其中PANI的聚合过程较为复杂，且制备的导电聚合物厚度不均匀；PEDOT的单体EDOT具有一定的毒性，且成本较高，需要使用气相聚合法进行反应，操作难度较大。而吡咯无毒，工业上制备非常容易，成本低廉，聚合过程容易操作，在三者中应用最多。其导电原理是：PPy结构有碳碳单键和碳碳双键交替排列成的共轭结构，双键是由σ电子和π电子构成的，σ电子被固定住无法自由移动，在碳原子间形成共价键。共轭双键中的2个π电子并没有固定在某个碳原子上，它们可以从一个碳原子转位到另一个碳原子上，即具有在整个分子链上延伸的倾向。即分子内的π电子云的重叠产生了整个分子共有的能带，π电子类似于金属导体中的自由电子。当有电场存在时，组成π键的电子可以沿着分子链移动^[35]，使PPy具有导电能力。

对于PPy聚合的方法，通常有电化学氧化法和化学氧化法，其中化学氧化法是在相应的反应溶液中添加氧化剂，氧化剂通常使用过硫酸铵（APS）、硝酸铁或三氯化铁，以引发聚合反应。在酸性条件下，氮原子结合H 后质子化，空位共振到2,5位，作为亲电试剂与另外一个吡咯氮上的电子反应从而完成聚合反应。PPy及其衍生物因其高导电性、良好的环境稳定性和较快的氧化反应速度，作为超级电容应用时的高能量密度，易合成，工业规模可用性^[36,37]而受到广泛的关注。

在前人做过的研究中有几项研究表明，PPy/BC纳米复合材料是通过在BC膜上PPy的原位氧化聚合制备的，用于作为柔性超级电容器^[38-39]。Wang及其同事在制备过程中采用冻干法获得了BC/PPy纳米复合材料^[38]。2013年，Muller等^[40]使用不同的氧化剂(FeCl₃·6H₂O和过硫酸铵)对吡咯进行氧化聚合，得到PPy/BC。以FeCl₃·6H₂O为氧化剂，制备了一种导电率为2.7 S cm-1，抗拉强度为4.1MPa的BC/PPy纳米复合材料。然而，尽管有一些工作研究了PPy/BC纳米复合材料的电导率^[39]，但只有一种情况下对其力学行为进行了表征。

1.5 研究目的

本工作的目的是先通过高碘酸钠氧化法制备可以自然降解的氧化细菌纤维素（OBC），再通过吡咯在水溶液中的化学聚合，以OBC和PPy为原料制备具有良好力学性能的柔性导电电活性膜。研究了PPy/OBC复合材料的力学性能、导电能力、细胞毒性、吸水溶胀特性，以及降解能力。

第2章 实验部分

2.1 实验仪器与试剂

表2.1 实验试剂

表2.2 实验仪器

2.2 PPy/BC复合材料的制备

2.2.1 BC膜的培养

由于BC膜使用木醋杆菌自行培养得到，所以需要先配制适宜的培养基。培养基的配方如下表2.3所示：

表2.3 木醋杆菌培养基配方

按照上表所示配方配制500mL培养基，使用取菌环进行木醋杆菌的接种。完毕后，将接种后的培养基置于摇床内，恒温30℃动态培养24h，使木醋杆菌均匀分布在培养基中，之后将培养基转移至烘箱内恒温30℃静态培养14天。培养好的BC膜直径约6-8cm，厚度约5-8mm，处理前为淡黄色胶状固体，见图2.1。