摘 要

羧甲基壳聚糖是壳聚糖的重要衍生物之一，而其磺化获得的硫酸酯由于结构性能类似于肝素类物质，具有极其广阔的发展空间和研究生产价值，因此，科研人员广泛把目光集中在羧甲基壳聚糖硫酸酯的研究方面。本文选择通过生物酶催化的方法，将丝素肽接枝到羧甲基壳聚糖硫酸酯上，以获得性能和活性更加优良的材料。本文通过红外表征，抗氧化能力测定，细胞生长活性等三个方面来研究新材料的性能，得到了新材料的一定数据，为羧甲基壳聚糖硫酸酯-丝素肽的应用提供一定的参考。

关键词：羧甲基壳聚糖；多肽；抗氧化能力

Abstract

Carboxymethyl chitosan is one of the important derivatives of chitosan, and its sulfonated sulfate is similar to heparin because of its structural properties. It has extremely wide development space and research value. Therefore, Focusing on the research of carboxymethyl chitosan sulfate. In this paper, the silk fibroin was grafted onto carboxymethyl chitosan sulfate by means of biological enzyme catalysis to obtain a material with better properties and activity. In this paper, the properties of new materials were studied by infrared characterization, determination of antioxidant capacity and cell growth activity. Some data of new materials were obtained, which provided some information for the application of carboxymethyl chitosan sulfate-silk fibroin reference.

Key words: Carboxymethyl chitosan, Polypeptide, Antioxidant capacity

目录

目录 5

第一章 绪论 7

1.1 引言 7

1.2 甲壳素和壳聚糖 7

1.3 甲壳素和壳聚糖的理化性质 7

1.4 壳聚糖的衍生物及其制备 8

1.4.1 壳聚糖的酰基化反应 8

1.4.2 壳聚糖的烷基化反应 8

1.4.3 壳聚糖的羧基化反应 8

1.4.4 壳聚糖的酯化反应 9

1.4.5 壳聚糖的季铵化反应 9

1.4.6 壳聚糖的交联反应 9

1.5 羧甲基壳聚糖（CMC） 9

1.5.1 羧甲基壳聚糖的应用 10

1.6 磺化壳聚糖 10

1.6.1 壳聚糖硫酸酯的理化性质 11

1.6.2 壳聚糖硫酸酯化合物的制备 11

1.6.3 壳聚糖硫酸酯的生物活性 11

1.7 选题依据 12

1.8 研究内容 12

第二章 羧甲基壳聚糖硫酸酯接枝丝素肽的制备及性能表征 13

2.1 引言 13

2.2 实验部分 13

2.2.1 实验药品及试剂 13

2.2.2 主要实验仪器 14

2.2.3 羧甲基壳聚糖的制备 14

2.2.4 酯化剂的制备 14

2.2.5 羧甲基壳聚糖硫酸酯的制备 15

2.2.6 羧甲基壳聚糖硫酸酯接枝丝素肽的制备 15

2.2.7 羧甲基壳聚糖硫酸酯-丝素肽取代度的测定 16

2.3 羧甲基壳聚糖硫酸酯-丝素肽的性能测定（CMCS对照三种取代度配制不同浓度） 16

2.3.1 羧甲基壳聚糖硫酸酯-丝素肽清除·OH自由基能力的测定 16

2.3.2 羧甲基壳聚糖硫酸酯-丝素肽DPPH自由基清除能力的测定 16

2.3.3 过氧化氢清除能力的测定 17

2.4 羧甲基壳聚糖硫酸酯-丝素肽对NIH-3T3细胞的影响 17

第三章 结果与讨论 18

3．1 FT-IR的表征 18

3.2 羧甲基壳聚糖硫酸酯接肽合成条件的优化 19

3.2.1 反应温度对制备的影响 19

3.2.2 反应时间对制备的影响 20

3.2.3 反应质量比对制备的影响 20

3.3 羧甲基壳聚糖硫酸酯-丝素肽的抗氧化能力测定 21

3.3.1 羧甲基壳聚糖硫酸酯-丝素肽清除·OH自由基能力的测定 21

3.3.2 羧甲基壳聚糖硫酸酯-丝素肽对DPPH的清除能力的测定 22

3.3.3 羧甲基壳聚糖硫酸酯-丝素肽对过氧化氢的清除能力的测定 23

3.4 羧甲基壳聚糖硫酸酯-丝素肽对细胞成长的影响 24

第四章 结论 25

参考文献 26

致 谢 27

第一章 绪论

1.1 引言

新世纪是探索开发海洋资源的世纪。伴随着陆地资源的日益减少，人们开发海洋，向大海索取能源与资源的需要变得越来越大。而中国作为海洋资源大国，拥有着异常丰富的海洋生物与非生物资源，随着我国经济的蓬勃发展，海洋产品的开发利用越来越多，在海产品的开发使用过程中，废弃的虾，蟹等食物的外壳处理也成为了一个难以解决的问题，而在这些节肢动物的外壳中，存在着大量甲壳素，如果我们能加以利用这些废弃外壳，回收其中的甲壳素，不仅可以大大节省处理垃圾的预算，还能增加水产品的资源利用率，使水产品收益有较大的增值^[1]。

1.2 甲壳素和壳聚糖

在1811年，法国科学家布拉科诺初次发现了甲壳素。1823年法国人欧基尔从动物外壳中提取得到该类物质，并将其命名为 chitin，中文称几丁质^[2]。它广泛存在于海洋中的许多低等的生物（如菌藻类）的细胞和甲壳动物尤其是节肢动物(如虾、蟹等)的外壳中。据估计，每年全世界甲壳质的生成量能多达上千亿吨^[3]。

壳聚糖(chitosan)，学名叫聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，又名脱乙酰甲壳素，是由几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的物质。自1859年，法国人鲁盖特首先提取出壳聚糖后，这种天然大分子被各行各业广泛关注，原因是其拥有很多异常优良的性能，例如血液相容性、微生物降解性等，所以壳聚糖在化工生产、食品药品、日用化妆品、废水处理、生物医学工程等诸多行业领域的研究应用有非常高的发展潜力。

1.3 甲壳素和壳聚糖的理化性质

甲壳质为白色或淡米黄色块状物，熔点在270°C左右，具有紧密的晶体结构，不溶于碱、水、有机溶剂，只溶于一些较强的无机酸（如浓盐酸，硫酸等）^[4]。

壳聚糖是一种白色、无固定形态、略带珍珠光泽的固体^[5]，在一般情况下，其不溶于偏碱性和中性条件下的溶液，只能溶于或者部分溶于盐酸、硝酸等稀酸溶液。表现壳聚糖性能的两个重要指标是脱乙酰度和粘度。通常将壳聚糖分为三种，粘度在 1000×10^-3Pa·s 以上的(1%的壳聚糖乙酸溶液)被定为高粘度壳聚糖，(1000～100)×10^-3Pa·s的被定为中粘度壳聚糖，1000×10^-3Pa·s以下的被定为低粘度壳聚糖^[6]。由于壳聚糖分子中所含-OH和-NH₂较多，而这些基团有很高的活性，使得壳聚糖这一多糖具备极强的化学活性，有良好的吸湿、保水、成膜、螯合等特性；并且，壳聚糖的醋酸性溶液有改善酸性体质、维持人体正常pH值的功能^[7]。

1.4 壳聚糖的衍生物及其制备

由于壳聚糖本身分子量大，溶解性较差，在很大水平上限制了它们的使用范围^[8]，但是壳聚糖分子中含有丰富的官能团，具有较强的生化反应活性。壳聚糖经过化学改性，得到的大分子衍生物，不仅可以保留壳聚糖自身的特性，并且可产生新的活性功能，能拓展其应用宽度。如今，壳聚糖的结构修饰研究主要包括烷基化、酰基化、羧基化、季铵化和交联等反应，获得的壳聚糖衍生物在食品医药、农业工业等方面得到广泛应用^[9]。

1.4.1 壳聚糖的酰基化反应

壳聚糖的酰基化反应是指在壳聚糖的氧或氮位上引进酰基的反应。酰基化反应在上发生时，即为O-酰化，则会生成酯；而在上发生，即为N-酰化，则生成酰胺，壳聚糖通常是同酰氯或酸酐发生酰基化反应，以便引入脂肪族或芳香族酰基。经过酰基化反应，壳聚糖分子间的氢键的作用力被削弱，其溶解性会因此提高。壳聚糖酰基化反应所生成的N-乙酰化壳聚糖膜其抗张强度和渗透能力，血液相容能力优异，不会被酸碱溶液腐蚀，因此可以用于制作膜及相关产物^[10]。

1.4.2 壳聚糖的烷基化反应

壳聚糖的烷基化反应即在壳聚糖分子链上的羟基的氧和氨基的氮上引入烷基，由于羟基上有一对孤对电子，具有很强的亲核性，所以其反应活性要大于羟基，最易发生烷基化取代^[11]。由于双二羟正丙基壳聚糖能够和阴离子良好的结合且稳定，因此常在洗发水的生产中使用 ^[12]，在医疗保健方面，烷化壳聚糖对某些革兰氏阴性菌有非常明显的抑制作用^[13]。

1.4.3 壳聚糖的羧基化反应

羧甲基化壳聚糖分子的一般获取方法是在壳聚糖分子上接上具有良好水溶性的羧甲基团，这一反应被称作为壳聚糖的羧甲基化反应。此种大分子产物有两性电解质的特性，因此极易溶于水，且具有优良的保水性和成膜性。CMC分为两种即O-CMC和N-CMC。O-CMC 能够用于抑制甲壳素酶和壳聚糖酶的活性，促进植物的生长等^[14]。N-CMC拥有优良的保温能力，稳定性好，抑菌性强，特别适合于抑制口腔细菌的繁殖 ^[15]，可以用于口腔医疗。

1.4.4 壳聚糖的酯化反应

壳聚糖的酯化反应通常是指壳聚糖上的活泼氨基或羟基与含氧类无机酸（如硫酸等）发生反应，生成壳聚糖酯类衍生物的过程。实验室常用的磺化剂有三氧化硫、浓硫酸、氯磺酸、亚硫酸钠等物质。壳聚糖硫酸酯具备显著的抑制动脉粥样硬化斑块形成的能力^[16]，具有良好抗凝功能，且其副作用较小。

1.4.5 壳聚糖的季铵化反应

季铵化壳聚糖是一种分子结构中含有季铵基的水溶性阳离子聚合物。同理于壳聚糖的烷基化反应，生成壳聚糖季铵盐的反应也主要发生于壳聚糖大分子中的氨基上，其反应机理是在氮位上引进了季铵盐基团。壳聚糖季铵盐具有较强的吸湿性和保湿性，与透明质酸相似，有望代替它成为化妆品的添加剂^[17]。并可用于制备包装用抗菌纸，具有良好的抗菌性能，其抗菌效果和壳聚糖季铵盐的浓度成正比。

1.4.6 壳聚糖的交联反应

壳聚糖的接枝共聚物是以具有一定分子量壳聚糖（称为预聚物或大单体）为主链，通过其官能团（活泼氨基和羟基）与聚合物的某些特殊位点反应，将两者直接结合交联从而获得接枝共聚物。戊二醛和环氧氯丙烷等是最常用的交联剂，反应在室温下就能迅速发生。

1.5 羧甲基壳聚糖（CMC）

在一众壳聚糖极其化学衍生物中，人们对于羧甲基壳聚糖的研究较为早，研究数量也较为多且深入。羧甲基壳聚糖（CMC）的制备通常是由壳聚糖在碱性环境中，向其中加入适量的氯乙酸，发生羧甲基化反应后得到的一类类肝素衍生物。壳聚糖大分子中可以发生羧甲基化反应的点位有三个，包括两个羟基（C₃和C₆）和一个氨基（存在于C₂位），由于三个基团的位置及电负性存在差异，它们的反应活性也因此不同。因为电负性氧大于氮，所以-OH的亲核反应要优于-NH₂发生，而对比C₃位和C₆位，由于伯醇基(C₆位)的反应速度要大于仲醇基( C₃位)，因此羧甲基化反应优先在壳聚糖的C₆位上进行^[18]。由于反应点位有三个，因此相应的羧甲基化产物就有氮氧位羧甲基化壳聚糖（N,O-CMC）、氧位羧甲基化壳聚糖（O-CMC）和氮位羧甲基化壳聚糖（N-CMC）这三种区别。

1.5.1 羧甲基壳聚糖的应用

1.5.1.1 医药方面的应用