摘 要

壳聚糖作为一种天然可降解高分子多糖，具有优良的生物相容性、血液相容性和生物安全性等。在各个领域受到了广泛关注，如生物工程、食品制造、化妆品等诸多领域的应用研究都取得了重大进展。羧甲基壳聚糖作为壳聚糖的衍生物改善了壳聚糖的水溶性，还具有许多优良特性，如抗病毒以及抗癌等特性。壳聚糖通过季铵化改性得到的水溶性衍生物壳聚糖季铵盐，不但保持了壳聚糖本身优良的生物降解性、生物相容性以及血液相容性，同时因为季铵盐基团的引入还拥有良好的抗菌性，吸湿保湿性等这些典型的季铵盐性质。在食品行业中，乳酸链球菌肽作为国际上许可使用的生物防腐剂，具有安全无毒无害的特点，近年来，乳酸链球菌肽作为一种天然抗菌剂在医药领域也逐渐得到研究。本论文以微生物转谷氨酰胺酶为催化剂，避免了因交联剂的引入带来的副反应和毒性作用将乳酸链球菌肽接枝到壳聚糖季铵盐上，制备的材料具有较好的水溶性、吸湿保湿性、抗氧化性、促进细胞增殖等优良性能，这为研究开发新型的生物材料奠定了良好的研究基础。

本文的主要研究内容如下：

通过转谷氨酰胺酶催化壳聚糖季铵盐和乳酸链球菌肽制备得到不同取代的壳聚糖季铵盐接枝乳酸链球菌肽的产品，并通过核磁等方法对合成产物进行表征，优化实验结果表明制备壳聚糖接枝乳酸链球菌肽的最佳反应条件为：反应温度为40摄氏度，反应时间为2个小时，羧甲基壳聚糖与乳酸链球菌肽的质量比为1.2;抗菌实验表明，在一定pH条件下，壳聚糖接枝乳酸链球菌肽对S.aureus和E.coli均有抑制作用；NIH-3T3细胞实验结果表明：在一定浓度范围内，随着取代度增高，细胞成活率相对会降低，但细胞成活率均在细胞毒性范围内，说明壳聚糖接枝乳酸链球菌肽基本无毒性。

关键词：壳聚糖季铵盐；乳酸链球菌肽；抗菌性；细胞毒性

Abstract

Chitosan as a natural biodegradable polysaccharide, has excellent biocompatibility, blood compatibility and biological security. Has attracted extensive attention in various fields, such as biological engineering, food manufacturing, application of cosmetics and other areas have made significant progress. Carboxymethyl chitosan as chitosan derivatives to improve the water solubility of chitosan has many excellent characteristics, such as antiviral and anticancer properties. Chitosan quaternary ammonium modified water-soluble derivatives of quaternary ammonium salt of chitosan, chitosan not only maintains the excellent biodegradability, biocompatibility and blood compatibility, at the same time because of the quaternary ammonium The introduction of salt group also has good antibacterial property, moisture absorption and other properties. The typical quaternary ammonium salt in the food industry, nisin as licensing international bio preservative, non-toxic harmless, in recent years, nisin as a natural antibacterial agent in the field of medicine has gradually get on. In this paper, microbial transglutaminase as catalyst, to avoid the side effects and toxicity caused by crosslinking agent to nisin was grafted onto chitosan quaternary ammonium salt, the prepared material has good water solubility, moisture absorption, oxidation resistance, excellent performance and promote cell proliferation, This laid a good foundation for the research and development of new biological materials.

The main contents of this paper are as follows:

The transglutaminase quaternary ammonium salt of chitosan and nisin were prepared with different substituted quaternary ammonium salt of chitosan grafted nisin products, and through the NMR method to characterize the synthesized products, optimization of experimental results show that the optimal reaction conditions for the preparation of chitosan grafted nisin is: reaction temperature is 40 degrees Celsius degree, reaction time is 2 hours, the quality of carboxymethyl chitosan and nisin is 1.2; antibacterial experiments show that under certain pH conditions, inhibitory effect of chitosan grafted nisin on S.aureus and E.coli were NIH-3T3 cells; The experimental results show that in a certain concentration range, with the substitution degree increased, the survival rate will be relatively lower, but the survival rate of cells in cytotoxicity within that chitosan graft nisin has no toxicity.

Key Words: chitosan; quaternary ammonium salt; nisin, antimicrobial activity; cytotoxicity

目 录

第1章 绪论 1

第2章 实验 4

2.1 实验材料和仪器 4

2.1.1 实验材料 4

2.1.2 实验仪器 4

2.2 壳聚糖季铵盐的制备 5

2.3 乳酸链球菌肽的纯化 5

2.4 转谷氨酰胺酶的纯化 5

2.5 壳聚糖季铵盐接枝乳酸链球菌肽的制备 6

2.6 壳聚糖季铵盐接枝乳酸链球菌肽的红外表征 6

2.7 壳聚糖接枝乳酸链球菌肽取代度的测定 6

2.8 壳聚糖季铵盐接枝乳酸链球菌肽抗菌性能测定 7

2.8.1 固体培养基和液体培养基的配制 7

2.8.2 菌种的活化 7

2.8.3 抗菌性能的测试 7

2.9 壳聚糖接枝乳酸链球菌肽对NIH-3T3细胞的影响 7

第3章 结果与讨论 9

3.1 壳聚糖季铵盐接枝乳酸链球菌肽的FI-IR表征 9

3.2 壳聚糖季铵盐接枝乳酸链球菌肽的合成条件优化 10

3.2.1 反应时间（t）对壳聚糖季铵盐接枝乳酸链球菌取代度的影响 10

3.2.2 反应温度（T）对壳聚糖接枝乳酸链球菌肽取代度的影响 11

3.2.3 乳酸链球菌肽与壳聚糖季铵盐质量比（m_nisin/m_QCS）对壳聚糖接枝乳酸链球菌肽取代度的影响 12

3.3 壳聚糖季铵盐接枝乳酸链球菌肽的抗菌性 13

3.4 壳聚糖接枝乳酸链球菌对细胞毒性的影响 13

第4章 结论 15

参考文献 16

致谢 20

第1章 绪论

近年来，人们在追求经济增长和社会进步的同时，开始日益关注能源与环境的保护。在高分子领域，科研工作者为来发出新型的、绿色的材料做出了大量的努力。天然高分子或是聚合物材料，由于来源广泛，而且具有生物相容性、无毒性、生物可降解性及可回收利用的等性能，引起了科学家们的极大兴趣，成为一个热门的研究领域，这些材料被广泛应用于生物医药、化妆品、食品、农业、催化剂载体、环境工程等领域。

皮肤是人体的免疫器官，具有在身体和环境之间进行自我更新和修复的功能。它是阻挡微生物侵入的有效屏障，对机械、化学、渗透、光和热损伤有保护的作用。部分伤口通过真皮是可以修复的，但是机体却不能修复皮肤的深部损伤。伤口愈合是动态和复杂的过程，需要细胞，细胞外基质组分，细胞因子以及生长等之间的相互作用。治疗通常包括手术清创术，使用局部抗菌剂和伤口敷料在临床中，有效的伤口愈合需要提供湿润的环境，支持气体扩散，防止微生物感染，去除过量的渗出物，并且可以容易地从伤口部位中除去而不引起疼痛。

组织工程旨在对损害和患病的组织提供支持细胞附着，增值和分化的支架材料。这种结构可以让细胞接种在支架上或是将活细胞于可凝固前体混合在一起注射到有缺陷的组织中。皮肤工程是基于将细胞接种到多孔可生物降解的聚合物支架上，作为真皮组织回复的起始平台并唤醒皮肤的再生。皮肤上口愈合是一个复杂的动态的过程，其包括几个阶段：止血、炎症、迁移、增值和成熟。皮肤收损后，身体的正常反应会自动修复损害，当受损程度较大，不能自动修复时，需使用伤口敷料进行治疗。用于皮肤修复的材料应具有生物降解性速率