1、目的及意义（含国内外的研究现状分析）

土壤是农业生产以及某些工业生产必需的最基本条件，是人类生存以及生活必不可少的中药资源。在如今经济飞速发展的同时，工业化所带来的土壤重金属污染也日趋严重。土壤重金属污染是指由于人类活动，使土壤中微量某些重金属含量超过背景值引发的一系列污染；由于重金属难以被降解，在土壤中过量沉积，经过不同生物体内吸收后逐级传递，不断浓缩，最后经过生物富集传递给人类，致使人类的健康安全收到极大的威胁。因此，展开对土壤重金属处理办法的研究显得尤为重要。

目前处理土壤重金属的处理方法主要有物理法、化学法和生物法三种。大量研究表明，硫酸盐还原菌的胞外聚合物（Extracellular PolymericSubstances， EPS）的生物处理方法拥有处理效果好、成本较低、易于操作和管理、无二次污染等优点，如今正逐步受到人们的重视。

胞外聚合物EPS是微生物在一定环境条件下在其体外分泌的高分子聚合物，EPS主要成分与胞内成分类似，如核酸、蛋白质、多糖等。EPS带有大量电荷和极性基团，因此可以为重金属提供大量吸附位点。硫酸盐还原菌（Sulfate-Reducing Bacteria， SRB）是一种厌氧的微生物，广泛存在于土壤、河水及地下管道等缺氧环境中，其分泌的EPS中的氨基、羟基和羧基官能团可以促进EPS与重金属的结合。

运用微生物固定化技术可使硫酸盐还原菌群的浓度升高从而提高EPS含量而使处理土壤重金属的效率大大增高。固定化载体材料的选择直接影响着选用微生物的活性以及对土壤重金属的处理效率，选用性能优良的固定化载体有助于提高土壤重金属的处理能力。

生物炭因具有多孔结构以及拥有丰富含氧官能团使其对重金属有良好的吸附效果已引起人们的广泛关注。国际生物炭协会将生物炭定义为在缺氧环境下生物质通过热化学转化得到的固定，其主要组成成分为碳。生物炭来源广泛，十分容易制备且具有环境友好、成本低等优点，因此选用生物炭作为固定化载体材料或将显著提高处理土壤重金属的能力。

基于现状，本课题结合硫酸盐还原菌分泌的EPS以及生物炭的优点，选择将生物炭作为固定化载体材料将EPS固定用来处理土壤中的重金属并研究其吸附重金属的性能以及达到最佳性能时的条件以期探寻出一种处理土壤重金属的新方案。

2、基本内容和技术方案

2.1 试验材料和方法

2.1.1 试验材料

菌种来源：武汉理工大学东院某花坛

2.1.2 试验仪器

A360型紫外可见光分光光度计；TDL-40B型低速离心机；MODEL868pH计；QYC-200型恒温培养箱；THZ-82型恒温摇床

2.1.3 培养基组成

(1)液体培养基的组成：

硫酸盐还原菌培养基：KH₂PO₄ 0.5g，NH₄Cl1.0g，NaCl1.0g，MgCl₂·6H_2shy;O 0.05g，CaCl₂0.05g，Vc0.3g，L-半胱氨酸0.3g，乳酸钠3.04g，Na₂SO₄2.22g。

(2)固体培养基的组成：

由液体培养基加上2%琼脂；

硫酸盐还原菌培养基：KH₂PO₄0.5g，NH₄Cl1.0g，NaCl1.0g，MgCl₂·6H_2shy;O 0.05g，CaCl₂0.05g，Vc0.3g，L-半胱氨酸0.3g，乳酸钠3.04g，Na₂SO₄2.22g，加入琼脂，培养基呈墨绿色；

以上培养基均在121℃灭菌20min。

2.2 检测方法

2.2.1 OD600的测量

将菌液摇匀，用蒸馏水作参比，在紫外分光光度计上于600nm处测菌液的吸光度。

2.2.2 镉浓度的计算

硫酸镉（Cd² ）的测定（镉-碘化钾-罗丹明B-三元络合物光度法）

(a)取50mL比色管6支，依次加入（0mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL）10mg/L 的镉标准溶液，首先向其中加入2mL硫酸溶液（1:9），充分振荡，再取碘化钾-抗坏血酸溶液3ml加入其中，摇匀振荡。再取10g/L的聚乙烯醇-1750溶液2ml，轻微倾斜摇匀，以防气泡产生。最后加入0.5g/L 罗丹明B溶液，摇匀，将溶液稀释至刻度。

(b)标准曲线

6个200ml容量瓶中分别加入0、0.50、1.0、2.0、3.0、4.0ml镉准贮备液(100mg/L)，用刚制备的去离子水稀释至刻度线，分别为0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mg/L硝酸盐氮。同上操作，测量吸光度。

(c)计算

硫酸镉(Cd² ，mg/L)=M/V*1000

式中：M——由校准曲线所得Cd² 量(mg)；

V——取水样体积(ml)。

2.2.3 铜浓度的计算

(a)标准曲线的绘制

50mL比色管16支，向其中依次加入0、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、10.00、15.00 ml 10μg/ml的铜标准溶液，再向其中加入过量的铜试剂标准溶液，再用氨水调节pH至9.0左右，在用去离子水定容后在452nm处测定对应溶液的吸光度值，并根据所得数据绘制标准曲线。

(b)浓度测定

将样品土壤置于烧杯中，向烧杯中加入1000ml去离子水，静置后取上层液体500ml置于另一烧杯中，加入浓硝酸调节pH至1~2并加热样品半小时至其沸腾，经沉淀冷却后取上层清液待测。

取30ml处理过的液体加入50ml容量瓶中，再向其中加入27μg/ml的铜试剂标准溶液10.00ml，用氨水调节溶液pH至9左右，并用去离子水定容，最后在452nm处测定溶液的吸光度值。重复以上步骤对该实验进行8次平行测定。

实验研究的方法

2.3.1 硫酸盐还原菌菌株的富集、初筛

以1g:10ml的比例用无菌水来稀释土样，再以1:10的体积比将土壤悬液接入至富集培养基中，在35℃厌氧环境下培养七天。培养基完全变黑，表面有气泡出现并且瓶口有臭鸡蛋味产生时，说明硫酸盐还原菌已经大量繁殖，可以进行下一步的分离纯化。

2.3.2 菌株分离纯化

(a)Hunahte滚管

制备含一定量的Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O的固体培养基，每支试管分装4.5ml，赶氧后121℃高温灭菌120min。滚管前，先将培养基在沸水浴中溶化，再将其转移至50℃恒温水浴中15至20min。再用2.5ml的无菌注射器吸取菌液0.5ml，并注入第一支试管内，振荡摇匀后，再从第一支试管吸取0.5ml菌液并注入第二支试管，同时将第一支试管水平放置于冰浴中滚动30s。重复以上操作，每瓶菌液分别稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4这4个梯度。

在35℃的厌氧环境下培养，直至试管管壁变黑形成黑色菌落。

(b) 菌落的挑取

制备含一定量的Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O的液体培养基，每支试管分装4.5ml，赶氧后121℃高温灭菌120min。

挑选分布稀疏并靠近管口的菌落作为目的菌落，缓慢打开试管帽，用无菌毛细管挑取菌落并快速移入液体培养基进行培养。

(c)二次滚管

重复(a)(b)的步骤直至获得纯化的SRB菌株。

2.3.3 最优生长条件的探究

首先采用单因素（温度、pH、硝酸盐浓度）试验，然后根据单因素试验的结果，设计正交实验。通过极差分析，判断各个因子水平影响的强弱程度，确定其关键因素。

2.3.4 EPS的提取

将土壤与蒸馏水的混合液样品在4500r·min^-1的转速下离心15min，静置，然后向去掉上清液的离心管中加入5%的氯化钠溶液至原始刻度线，摇匀后在60℃的水浴30min，之后再12000r·min^-1的转速下离心15min，上清液经过0.22μm水相滤膜过滤后即得到EPS溶液。

2.3.5 EPS的负载及其吸附效果测定

6个100ml容量瓶中均加入0.5g生物炭，再向其中分别加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml EPS溶液，并稀释至刻度线，充分浸润。

将负载后的生物炭取出分别放入6个烧杯中，再向烧杯中加入相同量被重金属处理过的土壤，充分搅拌，静置24h后，测定土样中的重金属含量，并根据数据绘制相应的吸附效果曲线。

3、进度安排

1-2周：资料检索、收集，文献查阅、整理；确定实验方案，撰写开题报告；

3-4周：准备实验仪器与药品；

5-13周：完成硫酸盐还原菌的筛选与分离，优化分离的细菌的生长条件，提取SRB分泌的EPS，并用生物炭进行负载实验，测定其处理土壤重金属的能力；

14-15周：实验数据处理及周撰写论文，制作答辩PPT，准备论文答辩。

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