1、目的及意义（含国内外的研究现状分析）

随着社会经济的高速发展，工业的快速扩张导致土壤中重金属元素富集日益加剧，高浓度重金属通过金属矿山、金属冶炼、化学生产、工厂排放、和污水灌溉等人类活动引入环境中，严重威胁着人们的健康。其中，我国每年因重金属污染导致粮食减产超过1000万吨，被重金属污染的粮食多达1200万吨，合计经济损失至少200亿元。重金属不像有机污染物，重金属不可生物降解，如锌、铜、镉、铅等可以通过食物链在人体内富集，从而对人体的免疫系统、泌尿系统、骨骼、神经系统、生殖系统造成损伤。其中镉超标率达到7%，位于无机污染物超标率榜首。因此，去除重金属、改善重金属对水以及土壤的污染问题迫在眉睫。

重金属常规处理方法有吸附、化学沉淀、电化学处理、离心交换、氧化还原、膜技术等方法。然而这些传统方法处理效率低下，不能有效去除重金属，并且成本高昂，消耗大量化学物质和能源。而微生物技术治理土壤是利用微生物来减轻或消除重金属污染。微生物修复的机理主要是通过微生物的生化作用将重金属固定，矿化，从而改变重金属元素在土壤中的存在形式，降低其在土壤中的移动性和生物有效性，具有无二次污染、处理成本低廉的特点。且单株微生物不能完成或者只能微弱地进行生物过程，必须依靠两种或者多种微生物共存的条件下，共生、共养、共荣，使微生物的作用朝着有益效果的方向发展，从而完成这一优化的生化过程。随着镉污染的治理在微生物技术中不断深入的研究，硫酸盐还原菌与产脲酶菌逐渐被人们所人使和了解。

其作用过程如下，产脲酶菌可将尿素水解为CO₃² 离子和NH₄ 离子，而SRB可将SO₄^2-还原为S^2-, 从而与土壤中的Cd结合，产脲酶菌产生的NH₄ 会使环境中pH增加, 减少SRB菌株SO₄^2-还原为S^2-过程中，pH降低对SRB菌株生长的抑制作用，并且使环境维持中性或者弱碱性还有利于抑制土壤中原生贝氏硫菌属、辫硫菌属等嗜酸耗氧微生物代谢，将SRB菌株生成还原性硫化物重新转化硫酸盐。且产脲酶菌属于好氧菌株，SRB是厌氧菌株。产脲酶菌可消耗土壤中的O₂, 持续降低环境中的OPR值，将其OPR降低到-100mv左右，以使环境显示出还原性，有利于SRB的生长。

2、基本内容和技术方案

2.1 试验材料和方法

2.1.1 试验材料

菌种来源：武汉理工大学东院某花坛土壤

2.1.2 试验仪器

A360型紫外可见光分光光度计；TDL-40B型低速离心机；MODEL868pH计；QYC-200型恒温培养箱；THZ-82型恒温摇床。

2.1.3 培养基组成

1. 硫酸盐还原菌培养液：KH₂PO₄ 0.5 g/L, NH₄Cl 1.0 g/L，NaCl 1.0 g/L

MgCl₂6H₂O 0.05 g/L, CaCl₂ 0.05 g/L, Vc 0.3 g/L，L-半胱氨酸 0.3 g/L。

2.产脲酶菌株筛选分离培养液：蛋白胨 1 g/L，NaCl 5g/L， KH₂PO₄ 2.4 g/L 尿素 2 g/L，葡萄糖0.1 g/L，0.2%的酚红溶液4ml,pH=7。固体培养基添加20 g/L的琼脂。其中, 尿素和葡萄糖分别单独配制为溶液灭菌后, 加入灭菌后的培养基。

3.产脲酶菌株生长培养基:蛋白胨1 g/L, 氯化钠5 g/L, 磷酸二氢钾2 g/L, 尿素2 g/L, 葡萄糖0.1 g/L , pH=7。尿素和葡萄糖灭菌方式与产脲酶菌株筛选分离培养基相同。

4.LB培养基:蛋白胨10 g/L, 酵母浸出粉5 g/L, 氯化钠10 g/L pH=7。

混合培养菌液设计：KH₂PO₄ 1.5 g/L，NaCl 2.5 g/L，葡萄糖 0.5g/L 乳酸钠 2.0g/L，NH₄Cl 1.0 g/L，MgCl₂6H₂O 0.05 g/L，CaCl₂ 0.05 g/L Vc 0.3 g/L，L-半胱氨酸 3 g/L，尿素 1.5 g/L，Na₂SO₄ 1.5 g/L。

2.2 检测方法

2.2.1SO₄^2-还原能力的测定(铬酸钡光度法)

原理：在酸性溶液中，铬酸钡和硫酸钡沉淀生成硫酸钡和铬酸盐离子。溶液中和后，仍析出过量的铬酸钡和硫酸钡，可过滤沉淀物。在碱性条件下，用硫酸代替的铬酸盐离子呈黄色。铬酸盐的吸光度已知是硫酸盐的含量。

(1) 铬酸钡悬浊液：19.44g铬酸钾(K₂CrO₄)24.44g氯化钡(BaCl₂·2H₂O)分别溶于1L蒸馏水水中加热至沸腾。黄色铬酸盐的混合生成沉淀，从上清液中倾出，用1L水洗涤和沉淀5次，最后加入水至1L以制备悬浮液并在使用(5升混浊级沉淀48MgSO₄^2-)之前进行良好混合。

(2) 硫酸盐标准溶液：1.4786g优级纯无水硫酸钠或1.814无水硫酸钾加蒸馏水至1L水(1.00mg/1.00mlSO₄^2-)

(3) 步骤：①分别取50ml比色管8支，加入(0ml、0.5ml、1.00ml、2.00ml、4.00ml、6.00ml、8.00ml、10.00ml)硫酸盐标准溶液至其中，然后加水稀释至25ml，分别添加盐酸( 2.5mol/L)盐酸1.0ml，摇匀，最后加热5分钟，静置。再加入铬酸钡悬浊液2.5ml，5分钟沉淀摇匀。②冷却后，逐滴加入(1:1，6.5 mol/L)氨水至溶液呈柠檬黄色(再多加两滴)。③沉淀过滤，定时(600 r/min，10min)离心，在420nm波长下测定溶液，测定吸光度用10mm比色计，记录书记，绘制标准曲线。

(4)计算：硫酸盐(SO₄^2-，mg/L)=M/V*1000

式中：M——由校准曲线查的得SO₄^2-量(mg)；

V——取水样体积(ml)。

2.2.2镉浓度的测定(镉-碘化钾-罗丹明B-三元络合物光度法)

原理：镉-碘化钾-罗丹明B-三元络合物高灵敏显色体系，在聚乙烯醇存在下，酸性条件下，Cd² 和I^- 及罗丹明B形成三元显色络合物，稳定时间可达1h。当质量浓度为0～3 g/25ml时，镉的质量浓度服从比尔定律。

(1)碘化钾-抗坏血酸溶液：20.0g碘化钾和2.0g抗坏血酸溶于100ml水中；罗丹明B(0.5g/L) 0.05g罗丹明定容至100ml。

(2)聚乙烯醇-1750溶液(10 g/L)：5.0聚乙烯醇于500ml水中微热之全部溶解。

(3)镉标准溶液1.000g/L：取0.9273g硫酸镉溶于500ml水，取1ml稀释100倍。

(4)步骤：①50ml比色管分别取6支，依次加入10 mg/L镉标准溶液(0ml、1.0ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml)，首先加入硫酸溶液(1:9)2ml，充分震荡，然后取3ml碘化钾-抗坏血酸溶液加入，震荡摇匀。再次取2ml 的10 g/L聚乙烯醇-1750溶液，轻微来回倾斜摇匀，防止产生气泡。最后加入1.5ml的0.5 g/L罗丹明B 溶液，缓慢摇匀，稀释到刻度。静置10min以后，在吸光度(1cm比色皿)621出测量，记录数据，绘制标准曲线。

(5)计算：硫酸镉(Cd² ，mg/L)=M/V*1000

式中：M——由校准曲线查的得Cd² 量(mg)；

V——取水样体积(ml)。

2.2.3尿素浓度测定

(1)尿素标准液：0.500g尿素定容于100ml容量瓶中，C=5.00g/L,分别取2ml、4ml、6ml、8ml、10ml、12ml、14ml、16ml以此加入100ml容量瓶中得到浓度（mg/L）分别为100、200、300、400、500、600、700、800系列标准液

(2)对二甲氨基苯甲醛:称取2，5000g溶解于500ml无水乙醇最佳波长426nm

(3)取10ml样品和0.5-1ml浓H₂SO₄和10ml对二甲氨基苯甲醛A=0.0006C 0.01168

2.3 实验研究的方法

2.3.1 菌株的筛选：

2.3.1.1硫酸盐还原菌的筛选:

配置4组硫酸盐还原菌液体培养基加入250ml锥形瓶中，再以体积比1：10的比例将土样悬液，接入富集培养基中，将四组富集实验置于35度、120 r/min的恒温摇床中，厌氧培养96h，当培养基变黑时，表面有气泡，同时瓶口有臭鸡蛋气味产生时，说明SRB已大量繁殖，可以进行下一步的操作。

配置硫酸盐还原菌菌株筛选固体培养基，每支厌氧试管分装5ml，在加入2%质量分数琼脂的条件下，121^oC高压蒸汽灭菌20min。滚管前，先将厌氧试管中的培养基在沸水浴中溶化，再移至55^oC恒温水浴15-20分钟。用2.5ml的无菌注射器吸取0.5ml菌液，注射入第一支试管内，快速混合后，再从第一支试管吸取0.5ml菌液注射入第2支试管，同时将第一支试管水平放置在冰浴中均匀摇动30s，重复以上操作，每瓶富集菌液分别稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4个梯度。涂布于制备好的三个平板上，最终将培养皿放置35^oC恒温厌氧条件下培养，直至SRB将SO₄^2-还原成S^2-离子，产生FeS试管壁变黑，形成黑色菌落。

继续挑选培养基变黑的原点状单菌落使用划线分离法接种到硫酸盐还原菌株筛选固体培养基制成平板上，继续保持35^oC恒温厌氧条件培养4h以上。重复多次实验，直至获得纯化的SRB菌株。在硫酸盐还原菌保存固体培养基上，用针刺法将划线分离过后的纯化菌落保存在小试管中，放入35^oC恒温厌氧条件下培养直至出现明显丝状菌落，最终得到硫酸盐还原菌。

2.3.1.2产脲酶菌株的筛选、分离、保存

称取三份等量镉污染土壤，分别加入到50ml的尿素溶液中，将其倒入250ml锥形瓶中，分别记录1、2、3号富集培养液，再将三组培养液置于37^oC、150 r/min的恒温摇床中培养24h。配置150ml产脲酶菌株筛选培养基，在121^oC高压蒸汽灭菌30min，冷却至55^oC,分别倒入1-9号平板中，冷却到室温，使用稀释涂布法，以10^-6、10^-7、10^-8、三个浓度梯度，将富集好的培养液稀释涂布于制备好的平板上，置于35^o恒温培养箱中。等平板长出菌落后，挑取菌落周围培养基变红的单个菌落，使用划线分离法接种到产脲酶菌株筛选培养基平板上，依旧在35^oC恒温培养箱中培养。重复以上步骤，直至分离出纯化的单菌株。将分离所得到的菌株接种到产脲酶菌生长培养基生长，于-5^oC冰箱中保存。

2.3.1.3SRB与产脲酶菌混合菌株的比例

利用响应面实验(RSM)的中心组合旋转设计方法(CCRD)研究混合生物成矿特性的研究，从中优化出混合菌最佳的成矿条件。基于两株硫酸盐还原菌与产脲酶菌的生长特性和底物利用特性，本实验中初步选定两株菌种的投加比例(A)的研究变量。变量的变化范围和水平通过测定镉沉淀含量用表格绘制出来，按照表中所示的不同比例水平同时接入混合菌剂培养基中，摇床转数150 r/min，培养温度35^oC进行培养，进一步培养24h后得到最优比例混合菌。

2.3.4 最优生长条件的探究

首先采用单因素，如温度、pH、碳源、氮源、盐度。然后根据单因素饰演的结果，设计正交实验。通过极差分析，判断各个因子水平影响的强弱程度确定其关键因素找到SRB与产脲酶菌各自最优生长条件。

3、进度安排

1-2周：资料检索、收集，文献查阅、整理；确定实验方案，撰写开题报告。

3-4周：准备实验仪器与药品。

5-13周：完成反硝化菌株的筛选与分离，优化分离的细菌的生长条件，测定在低温条件下的脱氮能力。

14-15周：实验数据处理及周撰写论文，制作答辩PPT，准备论文答辩。

参考文献

[1] 成亮, 钱春香, 王瑞兴, 等.2008.碳酸盐固化菌株A固结土壤Cd² 的生物固化过程[J].硅酸盐学报, 36 (1) :215-221苏丹.低温聚磷菌的筛选[J].内蒙古石油化工,2010,36(10):35-39.

[2] 魏仁超, 李焰, 许风玲, 等.SRB腐蚀与生物矿化作用的研究进展[J].材料开发与应用, 2013, 28 (5):101-108.WEI Renchao, LI Yan, XV Fengling[…]

[3] 方毅, 刘继伟, 谷庆宝, 等.生物矿化在环境保护方面的应用[J].硅酸盐通报, 2017, 36 (4):1209-1215.FANG Yi, LIU Jiwei, GU Qingsheng, e[…]

[4] 李想, 周俊, 王婷, 等.硫酸盐还原菌对多环芳烃降解的研究进展综述[J].净水技术, 2017 (3) :38-43.

[5] ZHANG G A, YUN, YANGL Y, et al.Galvanic corrosion behavior of deposit-covered and uncoveredcarbon […]

[6] 罗辉, 朱易春, 冯秀娟, 等.2015.重金属污染土壤的生物修复技术研究进展[J].安徽农业科学, 43 (5) :224-227

[7] 李萌, 郭红仙, 程晓辉.2013.土壤中产脲酶微生物分离及对重金属的固化[J].湖北农业科学, 52 (14) :3280-3282

[8] 李婧, 周艳文, 陈森, 等.2015.我国土壤镉污染现状、危害及其治理方法综述[J].安徽农学通报, 21 (24) :104-107

[9] 王瑞兴, 钱春香, 吴淼, 等.2007.微生物固化固结土壤中重金属研究[J].功能材料, 38 (9) :1523-1526,1530

[10] Li M, Cheng X, GuoH.2013.Heavy metal removal by bio-mineralization of urease producing bacteriaiso[…]

[11] Wang P., Li F.D.,and Liu D.J., 1993, Study on removing hexavalen chromium by sulfate-reducingbacte[…]

[12] 王明义，梁小兵，郑娅萍，赵由之，魏中青，硫酸盐还原菌鉴定和检测方法的研究进展。微生物学杂志，2005，25（6）：81-84

[13] 许燕波, 钱春香, 陆兆文, 等.2013.微生物固化修复重金属污染土壤[J].环境工程学报, 7 (7) :2763-2768

[14] 唐鹏飞, 许文杰, 王延飞, 等.2014.混凝沉淀处理含镉废水的效果及其作用机理初探[J].南华大学学报 (自然科学版) , 28 (3) :99-102

[15] Kumari D, Pan X, LeeD J, et al.2014.Immobilization of cadmium in soil by microbially inducedcarbon[…]

[16] 许凤琴, 代群威, 侯丽华, 等.2015.碳酸盐固化菌的分纯及其对Sr2 的固化特性研究[J].高校地质学报, 21 (3) :376-381

[17] 周东美, 邓昌芬.2003.重金属污染土壤的电动修复技术研究进展[J].农业环境科学学报, 22 (4) :505-508