摘 要

氮肥尿素利用率不高已成为当前农业亟需解决的关键问题之一。土壤中大量存在的脲酶是尿素无法被有效利用的主要原因，因而对脲酶活性及酶促反应特性进行研究至关重要。当前研究主要集中在通过对脲酶结构的改性来合成脲酶抑制剂，但对脲酶促使尿素水解反应的动力学和热力学的研究较少，无法为相应研究提供理论支持。

本研究以土壤为产脲酶菌的来源，从中筛选分离出可高效产脲酶的菌株UR-Q-2，并对其生长条件进行优化。通过对UR-Q-2的生长特性研究发现，该菌株的最佳碳源为葡萄糖，最佳磷源为磷酸二氢钾，最佳生长温度为37 ℃，最佳pH范围为8-9。在最优生长条件下，菌株UR-Q-2对20 g/L的尿素水解率达91.3 %。

37 ℃条件下，菌株UR-Q-2的动力学参数Km值为22.8 mmol·L^-1、Vmax 值为3.56 g·L^-1·h^-1；在pH为8时，Km值达到最小值12.64 mmol·L^-1，Vmax值达到最大值为2.09 g·L^-1·h^-1。该酶促反应活化能Ea值为93.64 kJ·mol^-1，在37 ℃时其热力学参数K值为0.12 h^-1，随温度升高K值增大；△H值为81.63 kJ·mol^-1，随温度升高△H值减小；△G值为91.06 kJ·mol^-1，随着温度的增加，△G值虽然表现出下降的规律，但幅度不大；△S值-30.41 J·mol^-1，随温度升高其值变化不大。

关键词：脲酶，动力学参数，热力学参数

Abstract

In recent agricultural production, the utilization of urea nitrogen is not high has become one of the key issues of agriculture needed to solve. There are a lot of soil urease urea is the main reason of urea be ineffectively utilized, thus urease activity and enzymatic reactions essential characteristics studied. Current research focuses on the study of the structure of the modified urease inhibitor to urea, but urea urease promote hydrolysis reaction kinetics and thermodynamics less, unable to provide theoretical support for relevant research.

In this study, the soil is the source of urease-producing bacteria, isolated from screening can produce urease strains UR-Q-2, and optimize the growth conditions. By studying the growth characteristics of UR-Q-2 found that this strain is best carbon source of glucose, the best source of potassium dihydrogen phosphate, optimum growth temperature is 37 ℃, the optimum pH range of 8-9. Under optimal growth conditions, 20 g/L of urea hydrolysis rate of 91.3%.

At 37 ℃, kinetic parameters Km strain UR-Q-2 value of 22.8 mmol • L^-1, Vmax value of 3.56 g • L^-1 • h^-1; at pH 8, Km value reaches the minimum 12.64 mmol • L^-1, Vmax value reaches a maximum value of 2.09 g • L^-1 • h^-1. The enzymatic reaction activation energy Ea is 93.64 kJ • mol^-1, at 37 ℃, the thermodynamic parameter K value of 0.12 h^-1, K value increases with increasing temperature; △ H value 81.63 kJ • mol^-1 with increasing temperature △H value decreases; △G value 91.06 kJ • mol^-1, as the temperature increases, △G value despite a declining law, but only slightly; △S value -30.41 J • mol^-1, with increasing temperature the value changed little.

Keywords: urease, kinetic parameters, thermodynamic parameters

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1引言 1

1.2脲酶 1

1.2.1脲酶的来源 1

1.2.2脲酶对尿素的分解作用 2

1.2.3脲酶对尿素水解机理 2

1.2.4脲酶抑制剂研究现状 5

1.3脲酶动力学和热力学研究介绍 5

1.3.1土壤酶催化动力学特性研究方法 6

1.3.2土壤酶催化热力学特性研究方法 6

1.4 研究的目的、内容及技术路线 7

1.4.1研究目的及内容 7

1.4.2技术路线 8

第二章 高效产脲酶菌株的筛选、鉴定 9

及其生长条件优化 9

2.1 引言 9

2.2 实验材料与仪器 9

2.2.1 土壤选取 9

2.2.2 实验仪器 9

2.2.3 实验药品 10

2.3 实验方法 10

2.3.1 培养基配方 10

2.3.2 产脲酶菌株的富集 11

2.3.3 产脲酶菌株的筛选 11

2.3.4产脲酶菌株的筛选的分离纯化 11

2.3.5 产脲酶菌株的保存 11

2.3.7 检测方法 11

2.3.7.1 脲酶活性的测定 11

2.4 结果与讨论 14

2.4.1 产脲酶菌株的富集 14

2.4.2产脲酶菌株的分离纯化 14

2.4.3 产脲酶菌株脲酶活性 14

2.4.4产脲酶菌株脲酶UR系列的生长曲线 16

2.4.5产脲酶菌株脲酶UR-Q-2的最佳生长条件优化 17

第三章 不同条件下菌株UR-Q-2分泌脲酶 23

水解底物尿素的动力学和热力学研究 23

3.1 实验材料与方法 23

3.1.1 菌株及培养基 23

3.1.2实验仪器 23

3.1.3实验方法 23

3.2 结果与讨论 25

3.2.1 不同底物尿素浓度下UR-Q-2水解尿素反应动力学及热力学 25

3.3.2 不同pH条件对UR-Q-2水解尿素反应的影响 27

3.3.3 不同温度条件对UR-Q-2水解尿素反应的影响 30

3.3.4 酶促反应的热力学参数分析 34

第四章 总结与展望 37

4.1小结 37

4.2 研究展望 37

参考文献 39

致 谢 41

第一章 绪论

1.1引言

氮是植物生长需要量较大的一种元素，然而大多数土壤中的氮元素含量较少，远远不能满足植物生长和粮食生产的需求，因此需要对土壤长期施用化肥来提高土壤肥力^[1]。联合国粮农组织(FAO)多年统计数据表明，化肥对农作物的增产有着很大的作用。我国的化肥使用量居世界第一位，但化肥的有效利用率还不足1/3，即施入土壤中的化肥有2/3未被有效利用，每年都有大量施入到土壤中的化肥在流失，被白白浪费掉。尿素是施用频率最高的一种氮肥，含氮率较高，分解速率快，其年损失量也是相当惊人。近10年来，虽然我国化肥使用量增长了81 %，但粮食增产量却仅为12 %^[2]。在农业生产中，化肥在农业生产资料支出中所占的比例最大，如何有效地提高化肥特别是尿素的利用率、使尿素降解为植物高效利用的氮源是当前农业需解决的关键问题之一。另一方面，无效分解的氮肥会造成对地下水的污染，并危害人的身体健康。因此，减少氮肥(尿素)的无效分解具有重大的经济效益和社会效益。

1.2脲酶

1.2.1脲酶的来源

脲酶在自然界是很常见的。他们通过多种有机体合成，比如植物，细菌，藻类，真菌和无脊椎动物等，也存在于土壤中作为一种土壤酶^[3]。提供反应的尿素基体是很容易获得的，它主要是通过动物排尿行为和死去的有机体中含氮化合物的降解。因此，由于尿素的存在，脲酶在自然界氮循环中有着非常重要的作用。其作用是以氨的形式为有机体提供氮元素。

土壤中的脲酶来源主要有两种，一是来源于高等植物根系分泌物。脲酶是植物吸收尿素以后用来分解为氨的一种至关重要的酶。虽然还没有彻底研究清楚，更高的植物可能由于多种更主动的尿素的转移系统，可以帮助他们根据可以获得的氮元素的种类来最优化氮元素的分布^[4]。在施肥过程中发现，植物通过根部吸收尿素，并由于脲酶的存在其可以通过尿素来合成氨。但是大量输入的氮元素既会对植物造成危害也会对环境造成危害。尿素是通过落叶输入的，通过落叶吸收尿素虽然很快，但是在高浓度时是有毒的。因此我们需要更深入地研究植物营养机理中和尿素相关的那部分，才能发展出更平衡的尿素施肥策略，从而达到最好的可持续农业种植。