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摘要

木质纤维素生物质是一种可再生和丰富的资源，具有生物转化为增值生物产品的巨大潜力。然而，由于缺乏可以克服昂贵的障碍的生物催化剂，例如从高温冷却，泵送氧气/搅拌，以及从酸性或碱性pH中和，生物精炼过程在经济上仍然不可行。细菌的极端环境抗性允许筛选和分离新纤维素酶以帮助克服这些挑战。使用纤维素酶测定和宏基因组文库的快速，有效的纤维素酶筛选技术是必须的。已经从类芽孢杆菌和芽孢杆菌菌株中分离出对可溶性和结晶纤维素具有活性的稀有纤维素酶，并且显示出在宽pH范围内具有高热稳定性和/或活性。来自像Cellulomonas flavigena和Terendinibacter turnerae等菌株的新型纤维素酶，产生具有更广泛底物利用的多功能纤维素酶。这些酶提供了增强纤维素酶的框架，包括：比活性，热稳定性或终产物抑制。此外，像梭状芽孢杆菌这样的厌氧细菌由于能够产生称为纤维小体的复合多酶复合物的物种而具有潜力。纤维素酶提供酶与底物的协同作用和紧密接近，增加对结晶纤维素的活性。这导致设计的纤维素体的构建增强了特定的底物活性。此外，产纤维小体的热纤梭菌及其将糖发酵成乙醇的能力;它对共培养的适应性以及基因工程的最新进展为生物燃料提供了一个充满希望的未来。在寻找改进的酶或策略中利用细菌提供了提高木质纤维素生物质转化可行性的手段，最终提供了“更环保”技术的手段。

关键词：细菌，生物转化，纤维素酶，纤维素酶

介绍

由于加速碳排放，石油基化石燃料的燃烧已成为全球气候变化的关注点[1]。化石燃料的燃烧也引起了对不稳定和不确定的石油资源的关注，以及燃料成本的上升[2]。这些担忧已经转移了全球努力，利用可再生资源生产“更环保”的能源替代品，这也可以满足世界的高能源需求。加拿大可再生燃料标准已经提高，燃料到2010年将含有5％的乙醇[3];到2009年，美国环境保护署将其可再生燃料标准提高到10.21％乙醇混合燃料[4];而目前巴西燃料中乙醇混合的使命是25％（2007年确定）[5]。

目前，美国和巴西分别是玉米和甘蔗作物生产淀粉/糖基燃料的领导者。这是使用传统技术从食物作物糖生产第一代燃料;然而，淀粉原料不足以满足日益增长的需求，并且是生物转化的一个有争议的资源[6]。淀粉基乙醇的温室气体减少也很少，因此，基于非食用作物（木质纤维素生物质）的第二代燃料正在获得巨大的全球和科学关注。木质纤维素生物质（“植物生物质”）是生物燃料生产的巨大潜在资源，因为它非常丰富，价格低廉，并且这些资源的生产对环境无害。农业残留物是木质纤维素生物质的重要来源，其是可再生的，主要是未开发的且廉价的。这些资源包括：来自玉米纤维，玉米秸秆，甘蔗渣，稻壳，木本作物和森林残留物等来源的叶子，茎和茎。此外，存在来自工业和农业过程的多种木质纤维素废物来源，例如柑橘皮废料，锯末，纸浆，工业废料，城市固体废物和造纸厂污泥。此外，生物燃料的专用能源作物可能包括多年生草，如柳枝稷和其他牧草原料，如芒草，百慕大草，象草等[6]。大约70％的植物生物质被锁定在5-和6-碳糖中。这些糖存在于木质纤维素生物质中，其主要由纤维素（由长链葡萄糖组成的同源聚合物）组成;不太常见，半纤维素（5-和6-碳糖的异源聚合物）;最重要的是木质素（一种复杂的芳香族聚合物）。主要成分纤维素是由葡萄糖单元组成的同多糖，通过beta;-（1→4）糖苷键连接。纤维二糖是纤维素中最小的重复单元，最终可以转化为葡萄糖。半纤维素是一种非均相聚合物，其组成从植物到植物以及同一植物的不同部分不同。它主要由戊糖（D-木糖，D-阿拉伯糖），己糖（D-甘露糖，D-葡萄糖，D-半乳糖）和糖酸组成。在硬木中，半纤维素主要包含木聚糖，而在软木中主要含有葡甘露聚糖。半纤维素的水解需要各种类型的酶。简而言之，木聚糖降解需要内切-1-4，-beta;-木聚糖酶，beta;-木糖苷酶，alpha;-葡糖醛酸糖苷酶，alpha;-L-阿拉伯呋喃糖苷酶以及乙酰木聚糖酯酶。在葡甘露聚糖降解中，需要beta;-甘露聚糖酶和beta;-甘露糖苷酶来切割聚合物主链。生物溶剂燃料如生物乙醇的生产有几个优点：1）由各种原料生产; 2）无毒; 3）容易引入现有的基础设施[7]。然而，可持续和经济上可行的生物燃料的道路受到阻碍。目前生物燃料的生产存在一些主要瓶颈;一方面，缺乏生物催化剂，其可以在木质纤维素材料生物转化为生物乙醇的高温和/或低pH条件下有效且廉价地工作。此外，非常需要从纤维素和半纤维素中经济地发酵衍生的糖。目前，木质纤维素的工业生物转化需要施加高温和酸性或有时碱性条件来分解木质素，降低结晶度，增加孔体积并溶解纤维素和半纤维素以允许酶水解目标多糖[8]。这个过程既昂贵又效率低下。因此，重要的是酶在高温和/或低pH或高pH条件下是稳定和有活性的。另外，木质纤维素到乙醇的工业生物转化在多个步骤中发生，其中在木质纤维素的预处理（糖化）之后添加水解酶，然后在另外的步骤中，将能够发酵的微生物添加到在水解期间产生的所得单糖中以发酵糖类生物乙醇。当前生物精炼过程的多样性使其既费时又昂贵。通过在称为联合生物加工（CBP）或糖化 - 共发酵（SCF）的过程中将糖化与发酵相结合，使用基于全细胞的方法，可以降低发酵和水解的成本[9,10] 。木质纤维素生物转化中的一些额外的限速步骤是纤维素的结晶顽固性和有限数量的纤维素酶。也就是说，鉴定的所有纤维素分解菌株在有效纤维素水解（内 - /外 - 葡聚糖酶，beta;-葡聚糖酶）所需的一种或多种类型的糖苷水解酶（GH）中是低的。为了提高木质纤维素生物转化为生物燃料的可行性，酶必须具有高吸附能力，高催化效率，高热稳定性和低终产物抑制。真菌和细菌都因其生产多种纤维素酶和半纤维素酶的能力而受到严重开发。最重要的是使用真菌，因为它们能够产生大量的纤维素酶和半纤维素酶，这些纤维素酶和半纤维素酶分泌到培养基中以便于提取和纯化。此外，酶通常不如细菌糖苷水解酶复杂，因此可以通过在快速生长的细菌宿主例如大肠杆菌中的重组更容易地克隆和产生。然而，来自真细菌的新型糖苷水解酶的分离和表征现在正在被广泛利用。这些变化有几个原因，例如，细菌通常比真菌具有更高的生长速率，从而允许更高的酶重组产生。其次，细菌糖苷水解酶通常更复杂并且通常在多酶复合物中表达，从而提供增加的功能和协同作用。最重要的是，细菌栖息在各种环境和工业环境中，产生对环境胁迫极其耐受的纤维素分解菌株。这些包括嗜热或嗜热菌株，嗜碱性或嗜酸性菌株，以及嗜盐菌株。这些菌株不仅能够在生物转化过程中发现的苛刻条件下存活，而且它们通常产生在极端条件下稳定的酶，这些酶可能存在于生物转化过程中，这可能提高酶水解，发酵和产物回收的速率。研究人员现在专注于利用和改进这些酶，用于生物燃料和生物产品行业。本综述将重点关注其他评论很少涉及的方面，如细菌筛选技术，以及通过比较不同的产纤维素酶细菌的新细菌纤维素酶。此外，它还将研究这些稀有纤维素酶如何帮助克服生物燃料行业的一些主要瓶颈。此外，本综述将讨论生物技术中一些新的细菌策略如何推动生物精炼领域的发展。细菌纤维素酶纤维素酶由独立折叠，结构和功能上独立的单元组成，称为结构域或模块，使纤维素酶模块化[11]。典型的游离纤维素酶由C末端的碳水化合物结合结构域（CBD）组成，其通过短的多接头区域连接到N-末端的催化结构域。纤维素酶水解纤维素只有两种作用方式，即转化或保留异头碳的构型。具有位于活性位点内的羧基的至少两个氨基酸通过酸碱催化催化反应。纤维素酶在聚合物上的通常描述的作用方式是外切或内切，并且所有纤维素酶都靶向beta;-1,4-糖苷键的特异性切割[12]。使用该分类系统，纤维二糖水解酶（外切葡聚糖酶）基于它们都从链末端切割beta;-1,4-糖苷键的假设被分类为外切作用。同样，那些真正表现出来的酶通常具有隧道形状的闭合活性位点，其保留单个葡聚糖链并防止其再粘附到纤维素晶体上[13-15]。另一方面，内切葡聚糖酶通常被归类为内切作用纤维素酶，因为它们被认为仅在内部裂解beta;-1,4-糖苷键并且似乎具有裂口形的开放活性位点。内切葡聚糖酶在纤维素的无定形区域上具有活性，因此可以使用可溶性纤维素底物测定它们的活性。即，羧甲基纤维素酶测定（CMCase）。然而，现在有证据表明某些纤维素酶显示出两种作用方式，即内外 - [16]。因此分类发生了变化;纤维二糖水解酶（外切葡聚糖酶）被描述为在纤维素的结晶区域上具有活性;而内切葡聚糖酶通常在纤维素晶体的更易溶的无定形区域上具有活性。在纤维二糖水解酶（外切葡聚糖酶）和内切葡聚糖酶之间存在高度协同作用，并且正是这种协同作用是纤维素晶体的有效水解所需的。 CBD是纤维素酶最常见的辅助模块，有54个不同的家族[17]。 CBD的主要功能是将其常驻催化结构域递送至结晶纤维素。结合使催化结构域与结晶纤维素紧密接触以进行有效水解。纤维素酶通过CBD的结合是非常稳定的，但仍允许酶横向扩散穿过底物表面，并且在一些情况下，CBD还显示催化结晶纤维素的纤维素链之间的非共价相互作用的破坏。其他一些CBD优先结合非晶体纤维素[18-20]。有趣的是，有氧Thermomonospora fusca家族9纤维素酶具有家族IIIc CBD，具有不同的功能，使家族9纤维素酶具有独特的主题[21]。这种独特的CBD不结合结晶纤维素，而是通过结合单一纤维素链并最终将该链进入酶的活性位点直接辅助纤维素酶的催化功能[22,23]。这有助于家族9纤维素酶的总体持续合成能力，即纤维素链的连续切割。另外，第二种类型的CBD必须与该纤维素酶结合以将其与结晶纤维素结合。此外，T.fusca的家族9纤维素酶为能够表现出内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶活性的酶提供了强有力的证据，突出了这些术语的模棱两可。外切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的产物分别是纤维二糖和纤维葡聚糖，它们的活性受到抑制。因此，有效的纤维素水解需要beta;-葡糖苷酶的存在以切割产生葡萄糖的最终糖苷键。通常，纤维二糖和纤维糊精被细菌吸收并通过纤维糊精磷酸化酶或纤维二糖磷酸化酶内部裂解以产生能量上有利的葡萄糖单磷酸。一些细菌还产生细胞间或细胞外beta;-葡萄糖苷酶以切割纤维二糖和纤维糊精并产生葡萄糖以被细胞吸收或被细胞吸收。纤维素酶产生菌的筛选和分离多年来，从多种来源分离出可培养的产纤维素酶细菌，如堆肥堆，腐烂的林业植物材料或农业废弃物，反刍动物如奶牛，土壤的粪便和有机物质，以及像温泉这样的极端环境，仅举几例[24]。筛选纤维素酶的产生可以通过微晶纤维素作为唯一碳源的富集生长来完成，然后提取16S rDNA / RNA以确定环境的分子群落结构并分析是否存在含有产生纤维素酶的物种的家族。具有纤维素酶潜力的菌株可以通过从作为唯一碳源的纤维素上的富集培养物进行传代培养来分离。该方法用于鉴定美国南达科他州Lead的Homstake金矿深层地下产纤维素酶细菌[25]。此外，有效的平板筛选方法是先决条件。筛选微生物分离物中的细菌纤维素酶活性通常在含有羧甲基纤维素（CMC）的板上进行[26]。该方法可以是及时的，并且水解区域不容易辨别。最近，Kasana及其同事发现用Gram的碘代替十六烷基三甲基溴化铵或刚果红进行板浸，可以得到更快速和高度可辨的结果[27]。然而，由于酶活性和晕圈大小之间的相关性差，使用染料的平板筛选方法不够定量或不够灵敏。由于实现了更高的灵敏度和定量，这引发了具有改变的具有生色/荧光基团的还原末端的短纤维寡糖的发展。荧光素，试卤灵和4-甲基伞形酮等几个例子已经很成熟[28-33]。将荧光底物掺入琼脂平板的主要限制是水解产物广泛扩散的趋势，因此这些种类的化合物不易使用。今天，合成了具有聚合度（d.p.）2-4（BTPG2-4）的新底物2-（2#39;-苯并噻唑基） - 苯基（BTP）纤维寡糖，用于在平板测定中筛选微生物纤维素分解活性。在纯化多粘芽孢杆菌纤维素分解复合物期间显示2-（2#39;-苯并噻唑基） - 苯基底物的有用性，所述复合物由至少三种类型的酶组成：纤维二糖水解酶，内切-beta;-D-葡聚糖酶和beta;-葡糖苷酶。 [34]。尽管如此，这些方法主要限于可培养的产纤维素酶细菌，并且该位点的全纤维素酶潜力（可培养和不可培养的微生物）未被充分检查。研究人员现在专注于从更极端环境中发现的不可培养微生物中鉴定和利用纤维素酶基因，希望所分离的酶具有新颖性，并且由于对恶劣环境条件的较高抗性而在生物精炼工业中具有特定应用。这些酶可通过对所用的酸或碱更具抗性并通过​​在较高温度下保持活性而有助于降低木质纤维素生物转化为乙醇的当前成本。为了从所有存在的物种中鉴定新的纤维素酶，可以快速培养和不可培养，应该创建宏基因组克隆文库，然后进行功能筛选;这项技术的关键特征是功能筛选。筛选需要知识或者更确切地说是分离具有特定活性的特定酶的目的，无论其是对微晶纤维素具有活性的外切葡聚糖酶还是对可溶性纤维素如羧甲基纤维素（CMC）具有活性的内切葡聚糖酶。根据目的，可以使用不同的测定来筛选在大肠杆菌中产生的重组蛋白。这是筛选广泛种群的一种快速有效的方法，最近通过筛选结晶和可溶性纤维素酶活性，用于从水牛瘤胃和纸浆和造纸厂污水沉淀物中鉴定出新型纤维素酶细菌[35,36] 。使用不同的筛选方法，已经鉴定了具有新特征的各种纤维素酶，并且至今仍在鉴定中。过去，纤维素酶的分离和鉴定在可培养微生物方面受到限制。然而，分子技术的最新进展，例如宏基因组文库的创建，将扩大可用于生物燃料研究的纤维素分解酶库。该方法将允许从其他不可培养的微生物中开发纤维素酶和相关酶，这些微生物可产生具有新特征的酶。产生新纤维素酶的细菌如前所述，分离，筛选和选择有利于从多种环境中发现几种新的产纤维素酶细菌。由于细菌之间的巨大差异，新纤维素酶的鉴定仍然是目前探索改善生物精炼工业的途径。这里将简要讨论一些新的细菌分离物和/或新发现和表征的纤维素酶，可能在生物精炼工业中使用。最近，通过16S rRNA基因测序和系统发育分析鉴定了先前从台湾台中的家禽粪堆肥中分离的细菌菌株B39，其是一种新的纤维素降解的Paenibacillus sp。应变。发现具有CMCase和Avicelase活性的高分子量（148kDa）纤维素酶被该分离物分泌到培养基中。新分离的纤维素酶的CMCase活性远高于对Avicel或滤纸的活性，并且发现该纤维素酶在60℃，pH6.5下具有最大的CMCase活性。由于该酶具有良好的热稳定性和轻微的酸性耐受性，因此在可溶性纤维素的水解以及对微晶纤维素来源的活性方面具有良好的工业应用潜力[37]。此外，在牛皮纸制浆工艺的

资料编号：[4385]