论文总字数：20215字

摘 要

分子中含有羧基以及氨基两种官能团的一类化合物称之为氨基酸。氨基酸的分析在各领域均有着非常重要的意义。

氨基酸中含有极性基团，且大部分缺少发光或者显色基团，进行色谱分析时容易带来干扰，因而直接分析效果不佳，提高氨基酸色谱信号和检测灵敏度的常用方法是对其进行衍生化后再进行分析检测，即所谓的间接分析法。

衍生化试剂的选择在该方法中极为重要，在选择衍生化试剂时必须综合考虑多方面的因素。选择合适的衍生化试剂能事半功倍。2,4-二硝基氟苯（DNFB）是一种良好的衍生化试剂，极容易和α-氨基酸的氨基在弱碱性的条件下发生取代反应，生成2,4-二硝基苯氨基酸（DNP-氨基酸）。DNP-氨基酸在360 nm左右有特征吸收峰，能够使用紫外-可见吸收光谱仪实现氨基酸的定量分析。另外，DNP-氨基酸在紫外光照射下能够发生光分解反应，根据侧链的不同产生不同的光解产物，这可能为氨基酸、多肽和蛋白质的结构解析提供新的方法。

关键词：氨基酸 衍生化 2,4-二硝基氟苯 光反应

Abstract

The molecule contains a class of compounds called amino acids, which contain two kinds of argon and amino acid. The analysis of amino acids is of great significance in various fields.

Amino acids contain polar groups, and most of the lack of luminescence or color rendering groups, chromatography analysis is easy to bring interference, so direct analysis effect is not good, improve the amino acid chromatography signal and detection sensitivity of the common method is to derive it and then analysis and detection, that is, the so-called indirect analysis method.

The selection of derivative reagents is extremely important in this method, and many factors must be considered when selecting derived reagents. Choosing the right derivative reagent can do more with less. 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB) is a good derivative reagent, very easy and alpha-amino acid amino acid amino acids under weak alkaline conditions to replace the reaction, the generation of 2,4-dinitrofluorobenzene amino acids (DNP-amino acids). DNP-amino acids have characteristic absorption peaks around 360 nm, and can use UV-visible absorption spectrometers to achieve quantitative analysis of amino acids. In addition, DNP-amino acids can react to photodecomposition under ultraviolet light exposure, producing different photolysis products depending on the side chain, which may provide a new method for structural analysis of amino acids, peptides and proteins.

Keywords：Amino acids；Amino acid derivatization; 2,4-dinitrofluorobenzene;

Photoreaction.

目 录

摘 要 I

Abstract II

目 录 III

第一章 文献综述 1

1.1 氨基酸 1

1.1.1 氨基酸简介 1

1.2 氨基酸的分类 2

1.3 氨基酸的分析方法 3

1.3.1 氨基酸的分析方法综述 3

1.3.2 氨基酸分析方法举例 4

1.4 氨基酸的2,4-二硝基氟苯衍生化 6

1.5 本课题提出 意义 7

第二章 亲水氨基酸的衍生化合成及其探究实验 8

2.1实验仪器及试剂 8

2.2 亲水氨基酸的衍生化合成 9

2.3 溶液的配置 12

2.4 氨基酸衍生化产物的质谱测定 12

2.5 吸收光谱的测定 12

第三章 结果与讨论 13

3.1 亲水氨基酸衍生化后的光谱性质 13

3.2 亲水氨基酸衍生化后的质谱性质 15

3.3 亲水氨基酸衍生化后的光反应 16

第四章 结 论 18

致 谢 23

第一章 文献综述

1.1 氨基酸简介

分子中含有羧基以及氨基两种官能团的一类化合物称之为氨基酸，其结构通式如图1-1所示。氨基酸是蛋白质的基础组成物质，可以参与组成生物细胞，形成生物组织，还能参与修复生物组织，在生命体中有着必不可少的作用。只要其他取代基有差异就可以形成不同的氨基酸，因而氨基酸种类繁多，在自然界中共有约300种。虽然自然界中氨基酸共有300多种，但是能参与构建蛋白质的氨基酸只有二十种。这二十种氨基酸我们称之为标准氨基酸或基本氨基酸。这20种氨基酸分别为：色氨酸（Trp）、甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、脯氨酸（Pro）、天冬酰胺（Asn）、苯丙氨酸（Phe）、蛋氨酸（Met）、组氨酸（His）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、亮氨酸（Leu）、半胱氨酸（Cys）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、酪氨酸（Tyr）、精氨酸（Arg）、谷氨酰胺（Gln）、组氨酸（His）、酪氨酸（Tyr）、赖氨酸（Lys）、谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）。

在人体内，氨基酸直接参与新陈代谢和组织生长，在人体内发挥着重要作用。例如氨基酸可以制造激素和酶用来调节和维持新陈代谢；氨基酸还可以参与制造制造血红蛋白用来对氧气进行传输。除此之外氨基酸还是组成精卵细胞的主要物质，直接影响生命的繁衍延续。

图1-1 氨基酸的结构通式

1.2氨基酸的分类

二十种基本氨基酸的疏水性、酸碱性、等性质各有不同，这是因为基本氨基酸的α位取代基的不同所造成的。按照酸碱性，氨基酸可分类为酸性氨基酸、中性氨基酸以及碱性氨基酸。碱性氨基酸由一个羧基和两个或两个以上的氨基组成，如精氨酸、赖氨酸和组氨酸等；酸性氨基酸由两个羧基和一个氨基组成，例如谷氨酸、天冬氨酸、等；中性氨基酸由一个羧基和一个氨基组成。按照氨基酸的疏水性可分为亲水氨基酸以及疏水氨基酸。苏氨酸（Thr）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、甘氨酸（Gly）、丝氨酸（Ser）、赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、组氨酸（His）、天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）为亲水氨基酸；其他8种氨基酸为疏水氨基酸。

按照人体对氨基酸的需求可以分为必须氨基酸、半必需氨基酸和非必需氨基酸。亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、和苯丙氨酸这8种氨基酸人体无法自己合成，只能由食物供给，因而称为必需氨基酸；除此之外，人体合成组氨酸丶精氨酸的能力不够满足人体自身的需求，必需通过食物摄取，因而这两种氨基酸称之为半必须氨基酸。其余的十种氨基酸人体都能够自己制造且能满足人体需求，因而称为非必须氨基酸。

1.3氨基酸的分析方法

1.3.1 氨基酸分析方法简介

氨基酸的分析在蛋白质化学和生物技术研究、营养学、卫生保健、临床症断、细胞生理学研究、农作物优良品种培育、制药、食品等领域均有着非常重要的意义。氨基酸分析方法主要分为以下两类，第一种是直接分析法，该方法是指直接对氨基酸进行分析，主要有高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法 (HPAEC-IPAD);第二种方法是将氨基酸进行衍生化反应生成有利于分离或测定的氨基酸衍生物后，再进行分析的方法，该方法称为间接分析法。由于只有极少数氨基酸具有生色基团，且其多在200 nm处左右产生吸收，而常用溶剂也在200 nm左右产生吸收，导致无法分辨是否是氨基酸产生的吸收，所以必须通过衍生化的方法将氨基酸分子转化为具有较强吸收的衍生物再进行测定，以此消除常规的紫外检测器直接检测存在的灵敏度低、背景高的缺点,。

我们常用烷基化、硅烷化、酰基化等方法将氨基酸衍生化成易挥发的非极性化合物以便于分离，这是由于氨基酸中含有氨基、羧基和羟基等极性基团，不易挥发,因而导致不利于进行气相色谱分析。总而言之，想要不同程度地改良化合物的检测灵敏度和色谱行为必须使用基于化学衍生化的方法。

衍生化间接分析法是目前氨基酸分析最普遍采用的方法。用于进行衍生化反应的试剂的选择在间接分析法中极为重要, 在选择衍生化试剂时必须综合考虑以下几方面的因素：①衍生试剂本身以及发生副反应生成的产物应不得干扰；②衍生化试剂不能与氨基酸发生反应，其性质必须稳定；③进行衍生化反应的条件应尽可能简单不能太复杂；④衍生化反应应与自动化不冲突；⑤该反应应尽量少产生有毒物质。

常用的衍生化试剂有邻苯二甲醛(OPA)、异硫氰酸苯酯 (PITC)、N-甲基三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)、6-氨基奎啉-N-羟基琥珀酰亚胺碳酸盐(AQC)丶异硫氰酸荧光素(FITC)、N, O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺 (BSTFA)、4-氟-7-硝基-2, 1, 3-苯并唑(NBD-F)、1, 2-苯并-3, 4-二氢咔唑-9-乙基氯甲酸酯(BCEOC)、氯甲酸芴甲酯 (FMOC-Cl)、萘-2, 3-二甲醛(NDA)和2,4-二硝基氟苯 (DNFB)等。

1.3.2 氨基酸的常用分析方法

⑴ 凯氏定氮法

原理:以蛋白质和氨基酸中的氮含量的值为根据, 测出样品中总的氮元素的含量, 由此推算出含氮的蛋白质和氨基酸的总量。特点:该方法具有较高的精准度。 但是也存在一些弊端，例如操作步骤繁琐、测量时间长且需要耗费大量试剂。

⑵ 分光光度法

原理:该方法的原理是不同物质对光的吸收具有不同的选择性。在紫外区只有少数氨基酸有吸收峰, 而且吸收光谱重叠影响很大，干扰了分析。而大部分氨基酸在紫外区没有吸收, 所以必须采取一定的数学手段，才能不通过分离手段实现对大部分氨基酸进行紫外分光光度法测量。卡尔曼滤波分光光度、偏最小二乘法分光光度法、多元线性回归分析分光光度法和目标因子分析分光光度法等方法都是目前普遍应用的数学分光光度法。对于紫外区有吸收峰的氨基酸的测定,不止有这一种方法，也有学者开发了新的方法, 如等吸光度法，利用不同的吸光度进行分析检测。还有其他诸如三波长分光光度法和双波长紫外吸收法也经常被用于紫外区有吸收峰的氨基酸。它的特点是速度快，不需要等待，并且容易上手不繁琐，但是精准度低、需要进行繁琐的计算。

⑶ 液相色谱法

原理: 溶液中不同的组分在流动相和固定相中的分配存在差异，导致当溶液各不同组分流动于在固定相和流动相这两个不同的相时,吸附-解吸这个过程会经历很多次，同时在这个过程中各组分完成分离。进行检测前一半会将氨基酸进行衍生化处理，这是因为大多数氨基酸没有生色基团，因而不具备光吸收和荧光的能力,因此需要对氨基酸进行衍生化处理使其转变为更容易进行分析检测的氨基酸衍生物。这样可使分离的选择性得到提高且使检测变得更加灵敏，可以反映出微小变化。柱后衍生法以及柱前衍生法是当前氨基酸的液相色谱分析的两种基础方法。

柱后衍生法:先用阳离子梯度淋洗交换柱把氨基酸混合物进行分离, 然后将上一步洗脱下来的氨基酸用衍生化试剂进行衍生化，得到可以具有紫外吸收或者具有荧光的反应产物, 最后用紫外分或荧光检测器测试氨基酸衍生物的特征光谱。柱后衍生法的优点是得到的氨基酸水解物十分稳定。但是该方法存在操作步骤繁琐、受多种因素影响的缺陷。例如目前应用较广泛的柱后衍生法——茚三酮柱后衍生法，需要提供低压环境才能进行。

柱前衍生法:该方法是先进行氨基酸衍生化反应,得到可进行色谱分析的氨基酸的衍生化产物，然后通过色谱进行分析检测，从而判断以及分离的一种方法。此方法是一种可靠的方法，具有很多优点，例如步骤容易，没有繁琐操作, 分辨率高，十分准确、并且此方法具有高灵敏度。同时此方法还具有很高的效率，分离18~26种氨基酸仅需要12~40 min。异硫氰酸苯酯 (PITC) 法、异硫氰酸苯酯 (PITC) 法、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯 (AQC) 法、邻苯二甲醛-巯基乙醇 (OPA) 法、芴甲氧羰基氯 (FMOCC1) 法丶异硫氰酸苯酯 (PITC) 法都是当前科学界应用最新的研究方法，被广泛应用。尽管柱前衍生有很多优点, 但是他的缺陷也是不可忽视的，例如,衍生化反应同时伴生的副反应可能会生产对检测造成干扰的物质，试剂本身亦会有干扰，而且该方法还存在着某些氨基酸衍生物检测途中可能分解或者转化为其他物质的问题，会对检测造成极大干扰。

⑷ 气相色谱法

原理:第一步先把氨基酸进行衍生化反应生成一种容易气化的物质以便进行后续反应, 第二步便是在一定温度下将其氨基酸衍生物进行气化产生利于进行下一步分离的气体。 由于此产物在固定相和气液液相间不同组分的分配存在明显差异，因而可以进行检测分析。该方法主要在两种反应中广泛应用,一种是生成七氟丁酰基 (N-HFA) 氨基酸丁基酯的反应，在此反应中气相色谱法发挥了重要的作用；另一种便是生成三氟乙酰 (N-TFA) 氨基酸正丁酯和的反应。气相色谱法效率很高，灵敏度很高，可以检测细微变化，并且还具有非常好的选择性，除此之外该方法的操作还并不繁琐, 很容易上手，质谱联用时还很方便, 可以很方便探究出氨基酸的结构，可以帮助研究者探究新的氨基酸。该方法应用十分广泛，近年来, 已在食品、医药、生化等方面广泛应用并受到好评。但是该方法同样存在缺点，主要是该方法必须进行衍生化反应, 因而带来了一些衍生化反应中的问题，例如衍生必须在严格的环境中进行,环境容易对反应造成干扰，而且必须用多根色谱柱才能测定多种不同的氨基酸, 样品还需要进行各种预处理，对环境还会造成污染。

⑸ 毛细管电泳色谱法

原理:该方法通过高压电场的电能驱动反应液通过以毛细管为主的通道进行分离。在流动中，由于样品中各成分之间淌度和分配行为存在不同，因而不同组分的分配存在差异，从而可以实现分离。芳香族氨基酸在可见光以及靠近紫外光处存在吸收，因而该类物质可直接采用紫外检测一步测定,。但是不是所有氨基酸都在该区域存在吸收，某些氨基酸在该

域既不存在吸收, 自身也无法发射荧光, 因而完全没有吸收峰。对于这样的氨基酸，我们通常先将其进行衍生化反应生成高吸收峰的氨基酸衍生物再进行紫外可见吸收或者荧光检测。同样，衍生方式叶有柱前、柱后之分，两种方法各有优缺点如上文介绍。商品仪器通常用柱前衍生, 因为他的衍生试剂比较稳定，不会发生其他反应高然检测，但有很多衍生化试剂都不稳定，易发生其他反应如OPA, 对于该种无助应采取柱后衍生方法进行衍生化反应

⑹ 电化学法

原理:该方法的原理是不同物质在溶液中的电化学性质各有不同,存在很大差异。因此如果能找到合适的电极，然后再将电极应用于氨基酸分离中, 即可对氨基酸进行电化学性质测定,从而检测出氨基酸的其他性质。通过该方法，氨基酸的其他性质可间接体现在电化学性质中，只需要检测电化学性质即可对氨基酸进行分析检测。一般采用直接电分析法的都是电活性比较强的氨基酸，例如酪氨酸、胱氨酸等，电活性弱的氨基酸无法使用方法进行检测，因为其电信号较弱。但是多数氨基酸在金属电极上没有电活性的，因而无法用该方法检测，这也是该方法的局限所在。对于无电活性的氨基酸一般先进行衍生化反应得到成具有电活性的氨基酸衍生化产物，然后进行间接检测，此处又涉及到衍生化反应的种种限制。该方法主要是操作非常简单，不需要繁琐操作，容易上手，而且无放射污染，对环境影响小，最主要的是它的灵敏度还很高，若是合理结合其他分离方法，将会达到事半功倍的效果，大大节约时间，节约人力。同样氨基酸的电分析法也有很多缺陷, 最主要的缺陷就是上文提到的大多数氨基酸不具有电活性，因而适用范围很小，不适用的还必须转化为衍生化产物才能进行检测，然后该反应受环境影响大，且可逆性选很差, 因此, 实际使用时，应合理选用，并且选择合适的反应条件。

1.4 氨基酸的2,4-二硝基氟苯衍生化

2,4-二硝基氟苯（DNFB），该试剂是由英国生物化学家Sanger率先发现的，sanger发现在弱碱性的条件下2,4-二硝基氟苯（DNFB）非常容易和α-氨基酸的氨基发生取代反应，该反应生成2,4-二硝基苯氨基酸（DNP-氨基酸），通常此反应称为Sanger反应，2,4-二硝基氟苯（DNFB）也因此被称为Sanger试剂。Sanger试剂的原理是DNFB会与多肽或蛋白质N-端的α-氨基反应，生成DNP-肽（图1-2）。在酸性条件下2,4-二硝基苯与氨基的结合非常牢固不易发生水解反应，而DNP-肽的肽键极容易发生水解反应导致DNP-肽全部水解。故而水解产物中除了氨基酸外还有N-末端的氨基酸与DNFB的结合产物，即DNP-氨基酸。用乙酸乙酯从混合液中提取出DNP-氨基酸。通过与标准的DNP-氨基酸的色谱比对，从而确定N-端氨基酸的结构。

从此之后，进行蛋白质或者氨基酸测序时Sanger试剂已成为常用的工具之一，是科学家探究新氨基酸结构的重要手段，该方法在多次实际应用中也得到了改进，目前已经非常完善。DNP-氨基酸在350 nm左右存在较强的吸收峰，这是由于苯环是典型的生色团，其在助色团硝基和氨基的增益下，吸收峰进一步红移，能够有效提高氨基酸的吸收信号。DNFB作为衍生化试剂具有多项优点，并且技术十分成熟。此方法结合其他分析手段，例如紫外吸收、凝胶电泳、圆二色谱（CD）以及高效液相等仪器，用于氨基酸的分离和识别、胺类化合物手性分析和其他胺类化合物（多是胺类药物）的分析检测，可以大大改善检测的精准度和灵敏度。

图1-2 Sanger试剂原理

1.5本课题提出的意义

我们发现氨基酸用2,4-二硝基氟苯衍生化得到的产物对光敏感，当用365 nm的光照射后能够发生光分解产物生成苯并吲哚衍生物，而氨基酸侧链取代基的不同，使生成的苯并吲哚的结构不同，由此我们可以进一步确认氨基酸的结构。在本课题中，我们将探究4个亲水氨基酸的DNFB衍生化产物的质谱和色谱变化，以及氨基酸衍生化产物的光反应变化。

第二章 亲水氨基酸的衍生化合成及其探究实验

2.1 实验仪器及试剂

2.1.1 实验试剂

2.1.2 实验仪器

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