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摘 要

Abstract II

第一章 前言 1

1.1 酶的固定化 1

1.1.1 固定化方法 1

1.1.2 固定化载体 2

1.1.3 酶固定化存在的问题 3

1.2 枯草杆菌蛋白酶的固定化 4

1.2.1 枯草杆菌蛋白酶简介 4

1.2.2 枯草杆菌蛋白酶固定化研究进展 5

1.3 静电纺丝 5

1.4 论文的研究内容 6

第二章 实验部分 8

2.1 实验药品及仪器 8

2.1.1 仪器 8

2.1.2 药品 8

2.2 静电纺丝制备聚丙烯腈（PAN）纳米纤维膜 9

2.3 基于改性PAN膜的枯草杆菌蛋白酶固定 9

2.3.1 多巴胺改性PAN膜的制备 9

2.3.2 PAN膜的戊二醛交联 9

2.3.3 枯草杆菌蛋白酶的固定化及酶固定量的测定 9

2.4 改性前后PAN膜的表征 9

2.5 枯草杆菌蛋白酶活力测定 9

2.5.1 酶解偶氮酪蛋白法 10

2.6 枯草杆菌蛋白酶催化水解偶氮酪蛋白动力学研究 10

2.7 固定枯草杆菌蛋白酶工艺条件的研究 10

2.6.1 pH对酶活力的影响 10

2.6.2 温度对酶活力的影响 10

2.6.3 热稳定性 11

2.6.4 重复使用性 11

2.6.5 自由酶、固定酶活性随保存天数的对比 11

第三章 结果与讨论 12

3.1 化学改性、酶固定后PAN膜形态结构变化 12

3.2 动力学分析 13

3.3 pH对枯草杆菌蛋白酶催化性能的影响 14

3.4 温度对酶活力，酶活保留率的影响 15

3.5 固定化枯草杆菌蛋白酶稳定性 16

3.5.1 反应过程中的热稳定性 16

3.5.2重复使用稳定性 17

3.5.3 储藏稳定性 18

第四章 结论 20

致 谢 20

参考文献 21

摘要

枯草杆菌蛋白酶因其较高的酶活力及pH稳定性被广泛应用于食品、药品、日用化学品等加工中。但生产过程中酶往往会因结构变形或是自溶现象而致失活，其稳定性有待提高，并且，游离酶难以回收。本研究将基于多巴胺改性的聚丙烯腈纳米纤维膜应用到枯草杆菌蛋白酶的固定中，以提升酶在操作过程的稳定性和重复使用性。扫描电镜结果显示蛋白酶被均匀地固定在PAN膜的径向纤维上。实验考察了固定酶及自由酶的动力学参数，酶经共价固定后，催化常数K_m由0.340增加到0.499。当pH=8.5，T=50℃时，固定酶及自由的催化水解活性均达到最大。相比于自由酶，固定酶的热稳定性提升了300%，储藏稳定性也有一定程度的提高。经8个反应批次后，固定酶维持了近50%的初始酶活力。

关键词：枯草杆菌蛋白酶 固定化 聚丙烯腈纳米纤维 稳定性 重复使用性

前言

生物水解法较化学水解法相比具有条件温和、催化效率高、副产物少等诸多优点, 酶作为生物催化的核心在医药农药、生物化工 、食品及环境保护等行业中得到了广泛的应用。酶一般以游离态酶、固定化酶、全细胞三种形式使用。

游离态酶单次催化效率高且单次使用成本低，但其容易受反应体系pH、温度的影响而导致失活，并且难以回收，因而难以在大规模连续工业生产中适用，固定酶技术应运而生。固定化酶较游离酶酶活有所降低，但大大增加了其稳定性能并且能够重复使用，便于从反应体系中分离，有利于生产的连续化，从而降低了生产成本。酶的固定化研究主要包括固定化方法、固定化载体选择及制备、固定酶最佳工艺条件的确定等方面。

酶的固定化

固定化方法

在酶的固定中，固定化方法对酶的固定及固定酶的性能影响很大。常见的固定化方法主要有吸附法、包埋法、共价结合法。

1.吸附法

吸附法按作用力可分为物理吸附与离子吸附。

物理吸附法没有化学反应发生，是一种温和的固定化酶方法，酶活力的保留率较高，并且载体可重复进行使用。但物理吸附一般吸附力较弱，酶固定不够牢固，在使用过程中容易造成酶的脱落；并且由于吸附过程是可逆的，载体酶负载量往往偏低。

离子吸附法是利用蛋白酶的氨基酸残基与固定化载体上的基团进行离子交换或是静电作用实现酶的吸附。例如谷氨酸、天冬氨酸上的羧基易电离出H 显负电，赖氨酸上的氨基易结合H 呈正电。较分子间作用力，离子键的作用力较强，因此经离子吸附的酶往往不易脱落。离子交换树脂常被应用作为离子吸附酶载体。虞英、蒋惠亮^[1]利用D311离子交换树脂对lipase进行固定化，最佳吸附量达98.26%。

2.包埋法

包埋法是将酶约束在固定的空间里，不涉及载体与蛋白酶的结合。包埋法操作条件温和，对酶的结构影响很小，因而具有较高的回收率。徐珊^[2]等以海藻酸钠、羧甲基纤维素钠(CMC)为载体，采用包埋法获得了比活为380 U/g的固定化脂肪酶。

由于酶的活性中心被固定在特定区域，且只有小分子才能在高分子凝胶中扩散，降低了酶促反应的效率。所以，包埋法往往只能适用于底物和产物均为小分子或是底物产物均可溶的催化反应。

3.共价结合法

共价固定过程条件严格，不光要求载体上有可用于共价结合的活性基团如氨基、酚基、羧基、吲哚基、咪唑基等，对酶固定的反应条件也有相应要求。对于表面没有或者缺少能与酶成键的官能团的载体，往往需要将其活化并引入可反应的基团。共价键合固定酶可以使蛋白酶与载体材料实现较为牢固的结合。共价结合法一般会涉及交联过程。酶固定过程中常见的交联剂有戊二醛、三氟氯氰、戊二酸酐等。戊二醛作为功能试剂可通过活化作用在载体表面的基团及酶上的氨基形成多个结合位点。

固定化载体

载体孔隙分布情况等会影响固定酶的微环境，直接影响到酶的活性、选择性和稳定性，因此载体需要良好物理化学稳定性。固定化酶的负载量主要与载体表面积的大小有关，表面积与载体材料孔隙率相关。多孔载体具有大的表面积，载体不仅可以负载较为大量的固定酶，而且还可以中和外部环境降解酶活性的影响。具有羟基、羧基、氨基等官能团的载体可以通过共价结合的方式与酶蛋白结合，这显著增加了载体和酶之间的结合，并促进了额外酶的固定。载体材料已经从自然界的无机、有机材料发展成以合成为主的人工高分子材料以及有机无机复合材料。

1.无机载体

SiO₂、Al₂O₃、活性炭等以其强度高、耐酸耐碱性强、简单易得、价格低廉等优点，常常被选作酶固定的载体，一般采取吸附法及包埋法用作酶的固定。无机载体固定酶主要分为两种：1.直接从自然界中获取或是采用制备得到的高吸附性能载体，采用物理方法将酶直接固定在载体上；2.通过以小分子对载体表面的改性调整无机载体的结构，采用共价键结合的方法固定酶。

陈仕伟^[3]等以活性炭为载体，在最适宜的pH、温度条件下对青霉素G酰化酶进行固定化，所得酶在最佳工艺条件下可重复使用12次而没有较大的活性损失。YANG K^[4]等以SiO₂为载体，通过固定葡萄糖氧化酶用于检测葡萄糖传感器电极的制作。刘进龙^[5]等将无机 6201型担体作硅烷化处理后作载体固定青霉素酰化酶，固定化酶酶学性质良好。

2.有机载体

有机载体主要通过共价结合的方式实现酶的固定。天然高分子材料价格低廉、具有良好的生物亲和性。壳聚糖、纤维素、胶原蛋白、明胶、海藻酸等材料可从自然界直接获得。张文勇^[6]等将壳聚糖作为固定糖化酶的载体取得了良好的固定化效果。

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