论文总字数：19734字

摘 要

在生物成像、生物传感器研究等技术的快速发展过程中，荧光探针已经在研究医学领域、生物学领域和食品安全领域等诸多难题的过程中体现了它巨大的研究价值。

荧光分子探针之所以在各个领域都得到了广泛的使用，原因是它相较于其他传统探针有很多的优点。第一是荧光分子探针具有很高的灵敏度，这种高灵敏度体现在它在使用的时候可以用来对单分子进行检测，第二是荧光分子探针的操作可以实现开关操作，而且它在分辨能力上都很突出，不仅在空间分辨能力上达到了亚纳米的级别，而且在时间分辨能力上也达到了亚毫秒的级别，第三是荧光分子探针的检测距离的优势，它可以进行原位检测和远距离检测，其中远距离检测是利用光纤维来完成的。

现在的研究领域，很多科学家都将研究的重点集中在对荧光分子探针的深入研究上，致力于研究能够靶向定位的荧光分子探针，并且希望这种定位能够具有特异性。本文着眼于一种细胞核探针，也可以称为DNA探针，细胞核在生物体的作用很重要，它是细胞的核心，是控制细胞的枢纽，它的作用主要是体现在细胞的运动当中，包括生长代谢等。而本文所合成的这种细胞核探针，名为DEAB-TO-3，将其合成工艺的难度以及最终的染核效果为研究对象，整个实验在文献合成路线的基础上进行改进和调整，降低了合成工艺的难度且对产率没有很大影响，简化了其合成工艺，实验初步确认了其应用价值。

关键词：荧光探针 细胞核 DNA浓度 粘度

Synthesis and Spectral Measurement of Dye molecules

Abstract

With the rapid development of biological imaging, bio-sensor research and other technologies, fluorescent probes have shown great research value in the field of medicine, biology, food safety and many other difficult problems.

Fluorescent molecular probes have been widely used in various fields because they have a lot of advantages compared to other traditional probes. First, the fluorescent probe has a high sensitivity. This high sensitivity is reflected in the use of the probe to detect the monomer, and the second is the fluorescent molecular probe. The switching operation can be realized, and it is very prominent in the resolution. It not only reaches the sub-manometer level in the spatial resolution, but also reaches the sub millisecond level in the time resolution. Third is the advantage of the detection distance of the fluorescent molecular probe. It can be used for in-situ detection and remote detection.

Now in the field of research, many scientists are focusing on the in-depth study of fluorescent molecular probes, and they hope that fluorescent molecular probes can be applied to the exploration of information, scientists are also working on fluorescent molecular probes that can be targeted. This paper focuses on a kind of nuclear probe, also called DNA probe. The function of nucleus in organism is very important and professional. It is the core of cell and the hub of controlling cell. Its function is mainly embodied in cell. Exercise, including growth and metabolism. The nuclear probe, called DEAB-TO-3, was synthesized in this paper. The difficulty of the synthesis process and the final nucleation effect were studied. The whole experiment was improved and adjusted on the basis of the synthetic route of literature. It simplified its synthetic process. The experiment preliminarily confirmed its application value .

Key Words: fluorescent probe; nucleus; DNA concentration; viscosity

目 录

摘 要 I

Abstract II

目 录 III

引 言 1

第一章 文献综述 3

1.1 荧光分子探针 3

1.1.1 荧光产生的原理及应用 3

1.1.2 荧光探针的设计原理 3

1.2 亚细胞器探针的分类及其特点 5

1.3 DNA,RNA的背景及检测意义 7

1.3.1 DNA的背景及检测意义 7

1.3.2 RNA的背景和检测意义 9

1.4 DNA,RNA目前的区分方法 10

第二章 DNA探针合成及应用 12

2.1概述 12

2.2 相关化合物的合成路线 14

2.3 实验部分 14

2.3.1 仪器与药品 14

2.3.2 合成步骤 16

2.3.3 化合物表征测试方法 18

2.4 结果与讨论 19

2.4.1 实验数据处理 19

2.4.2 过程分析 19

2.4.3 表征谱图 20

第三章 结 论 27

致 谢 30

引 言

随着科学技术的技能进步，荧光探针技术已经在各方面都有所运用，尤其在生命科学领域其应用的范围尤为广泛，尤其是生物监测，对于药物控释、靶向给药可以进行针对性的研究和表征[1]。荧光探针技术的优点可以理解为荧光分子探针的优点，这些突出之处恰好决定了这项技术能够被广泛地应用到医学、生命科学以及环境等多个与人类生活息息相关的领域，它以其灵敏度高和选择性好这两个最突出的优点在，在这些领域得到很大的发展，而且由于在很多领域包括生命科学领域需要研究的现象或者对象都是肉眼不可见的以及基因研究时对象也不可见，此时使用荧光成像技术就可以达到一定的便利，可以将这些微观现象给形象地展现了出来，使人们体会到了其中复杂的奥妙以进行更深入的研究与探索。
然而，现在科学家们所运用的荧光探针技术还存在很大的不足之处，而这个不足之处就是以后要突破的地方，现在所用这项技术主要由荧光增强来达到效果，局限之处在于现在运用的荧光探针都没有定位性，这里所说的是对于细胞核等亚细胞器的定位性，而这种技术上的局限之处也限制了科学家们对于某些特殊的生理过程的研究，这些研究已经不能用最基础的荧光增强的特性来满足，而是需要具备更准确更有效的荧光探针来实现研究。之前所提到的荧光分子探针的检测对象有金属离子、核酸等，比如说金属离子，它在生物体内是微量的，它的分布特别不均匀，科学家们在进行金属离子的定量研究这个领域就遇到了阻碍，传统的不具有靶向定位效果的荧光分子探针并不能有效地解决这一问题，因为金属离子的分布往往是在这里含量高，而在另一个区域含量会很低，相差甚大，此时就需要具有更高定位性的荧光探针应用到研究当中。此外，在分析局部区域的研究对象是，也需要用到亚细胞器靶向定位的荧光探针。

荧光成像是一种利用荧光物质的特性进行成像的技术。以紫外光线、可见光、激光为光源，利用荧光显微镜观察已被荧光染料染色的生物对象，以达到荧光成像的目的。荧光成像有诸多优点，如便于操作，直观表示，标记靶点多样和设计多样性。近年来,这一技术已被各领域的研究者们广泛应用于单分子的成像中。
综上看来，荧光分子探针具有定位的性质是很重要的，而对于各个生物体而言，细胞核的作用都是至关重要的，因此当我们需要检测细胞核中的遗传信息或者是基因等方面时，就需要运用到的荧光分子探针具有靶向定位的效果，直接将分子探针定位到细胞核当中，这种前提下在运用荧光显微镜来观察探针的效果、再对目标进行研究，就会达到很好的效果，荧光分子探针定位到细胞核中就可以达到荧光成像的目的，将其内部分裂、分化等各种生理活动完美地展现。

第一章 文献综述

1.1 荧光分子探针

1.1.1 荧光产生的原理及应用

荧光包括自发荧光和诱发荧光这两种，它是一种光致发光的现象，且不会产生能量，因此也是一种冷发光现象。光致发光是指可见光照射到原子的时候，由于光本身存在能量，致使原子中的电子受到激发从而发生跃迁，即原子核周围的电子在光的能量的作用下由低能轨道跃迁到高能轨道（从基态跃迁至第一激发态或者第二激发态等）。能量越低，状态越稳定，当电子发生跃迁之后，状态会恢复到基态，也就稳定了，此时能量释放，而释放能量的形式是通过发光，这种光即为荧光。因此，被光照激发的分子发射出的是分子荧光，这种现象即是光致冷发光现象。按照发射荧光的时间来分类的话，荧光可以被分为瞬时荧光和延时荧光两种类别。

荧光可以由两种方式产生，一是当光照射在某种物质上时，该物质会吸收光，从而产生了荧光现象，二是其他电磁辐射也会产生荧光现象。从波长和能量的角度来看，在大多数情况下，发光波长相较于吸收波长具有波长更长、能量更低的特点，但是也存在某些特殊情况，当吸收强度较大是，可能会出现双光子吸收的现象，这将会导致吸收波长较于发光波长更长的情况出现。当两者波长相等时，即出现共振荧光的情况。生活中，荧光可用于照明、生化和医疗、宝石和矿物以及仪器等领域。照明领域，荧光笔荧光灯均应用了荧光的原理。生化和医疗方面，人们通过化学反应将具有荧光性的化学基团附着到生物大分子上，检测荧光基团来探测目标的生物大分子[6]。人们根据荧光的作用研究发明了荧光分光光度计，这是一种检测型的仪器，它可以对物质内所含的荧光量进行探测，准确地将荧光含量检测出来。

1.1.2 荧光探针的设计原理

荧光探针的种类很广泛，接下来要介绍的主要是三大类，也是比较熟知的三类。首先，结合型荧光探针是一种很比较罕见的荧光探针，顾名思义，它是一种将有识别作用的基团与荧光基团相结合的荧光探针，这种结合是通过化学共价键来实现的，这种结合型探针的作用原理是通过把加入分析物前后的荧光强度的变化、光谱位置的移动或者荧光寿命的改变等要素进行对比以实现对分析物的检测[2]。其次，置换型荧光探针最突出的地方就是置换，这是一种用有识别作用的基团来置换的探针，这个基团作用的对象主要是被分析的物质，当然这种基团还会和荧光指示剂相结合，这就相当于基团将这两种物质从大环境中置换出来，这种荧光探针是根据这种结合能力来进行判断及检测的，因此，该探针对于识别基团和荧光指示剂的要求都相当高，对于荧光基团的选择要求是要对被分析物具有特异性识别的功能，而对于荧光指示剂的要求则是要与荧光探针能结合但结合能力既要弱于目标分析物与探针的结合能力，同时强于干扰物与探针的结合能力。最后要介绍的是化学计量型荧光探针，这种类型的荧光探针针对的对象比较单一，因此它具有专一性，其次这种荧光探针运用了之后就不可反转，即其不可逆性，具有这两种性质的计量型荧光探针还有很大的缺点，首先它的设计有很强的不可操作性，即设计起来比较困难，而且即使设计成功其实用效果也不好，因为这种探针的反应效果并不灵敏，由于这两点缺点的存在，计量型荧光探针的发展始终很有限。这种探针的分子与需要被识别的客体之间的化学反应是不可逆转的且具有一定的特异性，而计量型荧光探针的设计就是利用了这种反应的不可逆性，通过测量探针分子与客体发生反应之前和之后产生的不同的荧光信号来进行分析。

另外，荧光分子探针的响应机理主要包括以下几种：光诱导电子转移（PET，photo-induced electron transfer）、分子内电荷转移（ICT，inter-molecular charge transfer）、荧光共振能量转移（FRET,fluorescence resonance energy transfer）等[3]。第一种PET机理，顾名思义就是电子转移的过程，这时候的电子转移受到的外界的作用来源是光，发光的物质将光照射到接受到光的物质中，带动的就是两种物质内电子的转移，这整个过程中可能会产生荧光。第二种ICT机理，第一种是电子转移，到了第二种机理发生的不再是电子的转移，而是电荷的转移，同样也是由光源物质将光照射被接收光的物质上，这种机理在科学领域也有应用，根据这种机理设计出来的荧光探针在运用之后往往会导致荧光光谱的变化，这个过程是荧光集团上连接了一个电子基团，这个电子基团有一定的特质，首先它起到推拉作用，其次它的效果比较强。当运用到这种机理设计荧光分子探针的时候，往往检测的依据就是荧光信号的强弱。第三种FRET机理不同于前两种的电子转移和电荷转移，这种机理涉及到了三个部分，拿第一种机理打比方，FRET机理就是在发射光的物质和接受光的物质中加入了一个部分，这个部分就是起到连接作用的基团。这个机理转移的是能量，当然能量也是在发光物质和接收光物质之间转移，当两者距离合适的时候，能量就会由能量供体传递到能量受体上，而能量受体再以荧光的形式将能量释放出去。要设计成FRET，首先要一个荧光基团的吸收光谱要和另外一个荧光基团的发射光谱吻合，另外就是要这对能量合适的给体和受体荧光团之间的距离较小（一般为2-5nm）。根据Forster理论，共振能量转移效率可用下式表示

式中R为给体和受体两个荧光团之间的距离，R0为供体和受体之间的临界转移距离（即为Forster距离），因此，R的细微变化都会导致共振能量转移效率的巨大变化[7]。

1.2 亚细胞器探针的分类及其特点

探针可以分为荧光探针、电子探针、基因探针三大类。本文所研究的DNA探针就是荧光探针的一种，荧光探针具有灵敏度高和选择性强这两个主要特点，灵敏度高主要体现在两个方面，第一是离子或分子受体部分作为信号单位，第二荧光探针是利用一个连接基团连接信号和受体；选择性强主要体现在荧光探针与特定的阴离子相结合之后具有抗干扰、结构稳定、检测极限高的特点。

本文要介绍的几种荧光探针分别是线粒体探针、溶酶体探针、细胞膜探针和细胞核探针。

首先，目前还没有完善的设计线粒体荧光分子探针的法则，但基本原则已经显现，线粒体是一种由两层膜包裹而成的亚细胞器，且是一种半自主的细胞器，它为细胞的各种生命过程提供能量，一旦线粒体功能发挥异常，将会导致许多疾病的发生，因此线粒体探针应运而生。现有的线粒体荧光探针有三种，第一种荧光分子探针是一种带有正电荷基团的探针，这种探针因为存在正电荷，所以也就具备了一定的导向作用，而这种荧光分子探针是在线粒体的膜电位的基础上设计而成的，也正因为这种设计基础，使得探针能够准确定位到线粒体膜上。第二种是荧光分子探针可以标记到线粒体内的蛋白质或者多肤短链接在荧光分子上，因为这种标记是特异性的，所以就能够使荧光探针准确地定位到线粒体上。三是通过囊泡和胶束的包裹，将原本不能够渗透进入线粒体的荧光分子探针投入线粒体的内部，这个过程是线粒体膜的内吞作用在发挥作用，这种通过囊泡和胶束帮助而起作用的荧光探针也能够准确地定位到线粒体，但是内含物的释放效率一直是个研究难题。

其次，亚细胞器中包含溶酶体，它的形状是呈囊状的，另外它是作为一种单层膜的亚细胞器存在于细胞之中。溶酶体之所以称为溶酶体是因为它体内有很多水解酶，这些酶的数量可以达到六十种，酶既然要存活，则需要一个合适的环境，这些酶保持活性所需要存在的环境是酸性的。设计一个溶酶体荧光分子探针很重要的原因在于，溶酶体的作用在细胞内很重要，它关系着细胞的凋亡。溶酶体荧光分子探针有吖啶橙、中性红等染料探针，但这种探针作用并不好，这种探针的缺陷指出有以下主要四点：首先这种探针与水互溶性较差，这就给探针的使用带来了很大的不便，与水互溶性差使得探针大部分适用于有机溶剂的检测，遇到需要检测水中的氢离子等离子时就有很大的不便，其次是溶酶体荧光探针的激发波长的问题，激发波长短就会导致荧光散射现象的出现，而溶酶体荧光探针正好存在这样的问题，最后就是溶酶体荧光探针受外界影响比较大，一个是受光影响，另一个是受酸碱度影响，这种探针不耐光，并且对pH比较敏感受其影响较大。基于以上几点传统的溶酶体荧光探针的缺点，开发出新型的能够解决以上问题并且能够准确定位到溶酶体的荧光分子探针在当下看来就显得格外重要，并且新型的溶酶体荧光探针最好还是具有一些特定的性能，这样探针的效果就会更好，运用范围也会更广泛。

接下来是细胞膜探针。细胞膜是一种半透性膜，它的作用是控制细胞内外物质的进出，细胞膜有一个基本支架将其建立起来，这个基本支架是一个磷脂双分子层，使得细胞膜成为了选择性运输细胞内外物质的通道和桥梁。细胞膜所处的位置很重要，它是起保护作用的，因为它在细胞最外层，而这种保护作用很广泛，不仅仅是保护了细胞内部的成分，它还保护了细胞的架构。除此之外，细胞膜的重要性还因为它能传递信息，准确有效。细胞膜主要成分包括三个：占比最大的是脂质，其次是蛋白质，最后是糖类。细胞膜的基本支架磷脂双分子层不是静止的，它具有流动性，磷脂分子占了其组成成分的50%以上，而磷脂可以大致理解为磷酸和脂肪酸，其中磷酸头部分是亲水一侧，而脂肪酸尾部分是疏水一侧。细胞膜荧光分子探针是基于其探针分子自身的两亲性或者连接在两亲性的脂质分组上的，然后利用其亲水和疏水的特性定位到细胞膜上。

最后是细胞核探针，本文所合成的DNA探针就是一种细胞核探针。细胞核的核膜作用很重要，首先它的结构很特别，核膜的组成的双层的膜，主要的组成成分不仅有磷脂分子，还有蛋白质分子，核膜上有核孔，这种核孔主要是大分子物质的通过途径。染色质存在于细胞核中，顾名思义，它是一种能够被染色的物质，将其染成深色通常使用的是碱性染料，它是由蛋白质和DNA组合而成。在细胞分裂期，染色质可以理解为是遗传物质，它是这个时期遗传物质的表现形式。染色质区别于染色体，细胞分裂阶段，染色体是该阶段遗传物质的一种特殊的表现形式。染色体是染色质在细胞分裂时期的一种特殊表现形式，这种表现形式称为螺旋化，经过螺旋以后染色质具有了一定的结构，从而形成染色体。细胞核探针是一种典型的亚细胞器探针，且细胞核具有高度专一的特点，因此细胞核探针在运用到各个领域时也会具有这一特征。细胞核存在于生命机体中，它是机体细胞信息处理和管理的中心。细胞核探针的作用在于其在生命科学领域，这种对细胞内的细胞核及染色体进行标记的技术在生命科学和生物医学领域的研究己经十分广泛。

1.3 DNA,RNA的背景及检测意义

1.3.1 DNA的背景及检测意义

DNA或脱氧核糖核酸是人类和几乎所有其他生物的遗传物质，携带着用于生物体的生长，发育，功能和繁殖的基因说明。大多数DNA位于细胞核（它被称为核DNA），但是在线粒体（也称为线粒体DNA或线粒体DNA）中也可以找到少量的DNA。

DNA的两条链彼此以相反的方向运行，DNA分子是一条长链，是由四个单位连接而成的，这四个单位是四种物质，名为脱氧核苷酸，为A，T，C，G。DNA作为细胞内最重要的遗传物质，它是一种很复杂、很深奥的物质，其中的四种碱基中任意三种随意排列组合会形成一个部分，这个部分即是一个密码子，这种密码子就携带了一定的生物的遗传信息，而正是这种随机变换的排列方式导致了基因的排序具有变化多端的特质，也正是这种特质对生物遗传的变异这一情况起到了决定性的作用。DNA在生命科学领域的研究广而深，现代科学中有许多对DNA的检测以及对DNA 深入的研究等科研形式，最终的目的都是为了对DNA中基因携带的遗传信息进行研究分析并识破控制这些遗传信息的染色体的准确位置，这种针对DNA的研究以及对其中遗传信息的探索在医学、生物科学以及制药等多方面都有很大的作用，是这些领域技术开发、创新研究的灵感来源。与人类最息息相关的检测是在医学领域针对人类基因组的研究，因为基因决定着人体健康的内在因素，科学家们致力于对人类基因的检测，他们探索基因的排列顺序并对其进行检测，他们在对人类基因的研究基础上进行了一些研发工作这些对于基因的不断探索地深入研究在基因技术领域都带来巨大的冲击，这是一场伟大的革命，这场在基因领域的革命对于现代社会的医学、生物科学等都有巨大的推动作用，使这些领域迈入了一个全新的时代。

DNA的研究及检测在现代科学领域作用很大，它已经帮助我们解决了多方面的问题。首先在基因鉴定的领域，常常用在个人身份的确认以及亲属身份的鉴定，在生活和刑侦等多个方面都带来了很大的帮助，携带遗传信息的染色体存在于DNA中，故而对于DNA的检测可以鉴定个人的身份等。其次是基因检测的领域，针对基因的检测不仅可以对许多遗传疾病进行研究，在国外，基因检测还被广泛应用于对于祖先的构成的研究。接着是基因制药的领域，设计药物是一件很困难的事，需要基于对病症的研究和对药物的熟知才能达到效果，基因技术的应用使得科学家们在制药的时候以基因组的研究成果为参考原理，从而达到制成基因相关的药物的目的，大部分基因药物的作用是靶位与受体的确定。因为在基因检测领域已经对靶位受体有了成熟的研究及成果，因此以基因研究为基础制药不仅减少了研制药物的时间还节省了其中所用到的费用，可以说DNA检测在基因制药领域的运用对于全人类而言是一种非常有力的推进，使得药物的开发达到了一个新的高度。最后是基因治疗的领域，前面提到的基因检测领域运用DNA技术对于遗传病等问题进行基因检测，而在质量方面，则是已经找到了其中病变的基因，通过引入健康的基因的方式来取代原本已经病变或者破损了的基因从而对相应的疾病进行治疗,基因治疗是在基因检测基础上的发展，不仅仅是探查到了有问题的基因的存在，更进一步的是它将这些问题通过同样先进的方式解决，现代社会科学家们的研究领域中，这种方式被视作遗传疾病的唯一解决方案。DNA检测的研究的脚步从未停止，在不久的将来通过在人体内置入解决疾病的相关基因将会在医学领域有不可限量的前途，甚至可以找到许多现在看来依旧是不治之症的解决方案。
DNA核酸探针是指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针，现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针，这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列[4]。这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用,以细菌为例，加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景[4]。

1.3.2 RNA的背景和检测意义

RNA与DNA有相同之处也有不同之处，相同之处在于它也是核糖核酸，而且也携带遗传信息，与DNA不同的是，它主要存在与生物体的细胞当中，另外RNA还会存在于病毒和类病毒之中。RNA和DNA都是核酸，并且与脂质，蛋白质和碳水化合物一起构成所有已知形式生命所必需的四大主要大分子。像DNA一样，RNA被组装成核苷酸链，但与DNA不同的是，在自然界中更常见的是将单链折叠成自身，而不是成对的双链，并由更短的核苷酸链组成。细胞生物体使用信使RNA（m RNA）传递指导特定蛋白质合成的遗传信息（使用含氮碱基鸟嘌呤，尿嘧啶，腺嘌呤和胞嘧啶，由字母G，U，A和C表示）。许多病毒使用RNA基因组编码它们的遗传信息。
RNA有众多种类，包括r RNA、m RNA、t RNA等，负责传递遗传信息、转运氨基酸等重要工作。研究证明，RNA不再只是联系DNA与编码蛋白质的信使。早在20世纪70年代，研究就已经发现了大量的非编码RNA，其作用不再只是编码蛋白质，它有了进一步的作用，RNA的存在能够对多种生物学信号的通路起作用，达到一种调节的效果，并且RNA可以对基因的表达进行一定程度的调控。RNA中也有可以用于医学研究的部分，这是一种大量存在的RNA，形态上呈现环状，称为circRNA,而且这种RNA存在的范围主要是哺乳动物的细胞中看，因此在医学领域有很大的作用，而且参与多种人类疾病的发生、发展，发挥了重要的调控作用。如果对其进行测定与研究，可能有助于疾病的诊断和治疗，甚至可以作为临床诊断的靶点，对症下药。

1.4 DNA,RNA目前的区分方法

第一，最简单而便捷的是粗鉴定，所谓粗鉴定就是利用染色剂来区分，使用的染色剂是甲基绿和吡罗红，这两种试剂为碱性试剂，使用时不仅要混合使用而且要现配现用。显色的原理是甲基绿和吡罗红对DNA和RNA的结合能力不同从而导致显现出不同的颜色以区分DNA和RNA。若是DNA，则会显现出绿色，原因是甲基绿与DNA相结合，若是RNA，则会显现出红色，此时是吡罗红与RNA结合的结果。之所以甲基绿会选择DNA结合而吡罗红选择RNA结合是因为两者与染色质中的这两种遗传信息载体的亲和能力不尽相同。但是这种方法仅仅用于定型鉴定有无DNA或者RNA的存在，并不能定量检测出这两者的含量，不过即使仅仅用来判断，这两种染色剂混合使用的区分方法在各个领域的实验室也都有使用，原因是该方法不仅方便而且有效准确。

第二，这种方法不同于第一种借助外物来区分，而是根据DNA、RNA本身的性质不同来区分两者，即通过两者在不同溶剂中的溶解度不相同来区分。首先DNA和RNA 都溶于水，因此水并不能用来区分这两种物质，但是DNA和RNA不溶于乙醇，因此当需要鉴别一个物质中是否还有DNA和RNA时，可以将其加入乙醇中，若有物质沉淀，则为DNA和RNA。接着用到的区分溶剂是苯酚，DNA和RNA中只有DNA溶于苯酚，所以当将前面被被乙醇沉淀下来的物质加到苯酚中时，就可以将RNA沉淀下来，最终达到区分两者的目的。

第三，是通过仪器来检测，即光谱分析，根据已知的知识可以了解到DNA和RNA的吸收光谱存在差异，因此这一不同之处就可以用到区分这两种物质当中，通过对某种物质的光谱分析，观察其吸收光谱，则很容易测量出微量RNA的存在从而做到区别两者。

最后，这种方法则是测量DNA的分子量，直接而有效。使用溴化乙锭溶液(EB)用来充当染色剂，用它去对DNA进行染色，这种方式可以将所有任何形态的DNA都变成线形的状态，线性状态下的DNA的长度容易检测，因此用电镜测量出DNA的长度，根据B型DNA计算BP数，得到BP数以后要得到DNA的分子量要进行接下来的计算，这种计算则是要以核苷酸的平均分子量为依据而得到结果。

第二章 DNA探针合成及应用

2.1概述

脱氧核糖核酸(DNA)是一种生物大分子，分子结构复杂，它作为染色体的重要成分主要存在于细胞核中，是生物遗传信息的承担者。DNA作为一个大分子有机化合物，它的主要组成成分是核苷酸，DNA的主要功能是复制与传递，可作用于遗传信息等。1953年，英国生物学家克里克与韦尔金斯将DNA的结构描述为一种双螺旋结构：有一个中心轴，四周围绕着一对多核苷酸链的形态。DNA结构的损伤在癌症领域一直是诸多专家的研究关注点，一旦DNA的结构受到损伤，DNA的浓度就一定会受之影响从而产生变化。DNA结构的损伤在医学领域具有两面性，虽然，由一些内源性或者外源性因素引起的DNA结构损伤不仅极有可能引起基因突变还有可能导致细胞癌变，但是同时许多抗癌药物的原理就与DNA结构损伤有关，这些抗癌药物一方面能直接地损伤DNA，另一方面能间接地阻止这种损伤的恢复。

DNA探针是一个人工合成的单链DNA片段，DNA探针的作用很明确，在于快速地检测目标物质，主要是检测病原体之类的对人体有害的物质。该探针具有一个普遍性的特征，它往往大部分具有放射性。DNA探针之所以可以快速而又准确地检测到病原体等目标物质，是因为它所运用的模板就是病原体物质的DNA当中的一个片段，这个片段是一个易于被检测出来的特异性片段。DNA探针除了大部分具有放射性以外，还有一部分是被生物素标记了的，因此DNA探针的准确性很高。DNA探针应用的范围很广，它可以用来标记同位素、生物素、荧光染料等物质。制成的DNA探针可以和固定在硝酸纤维素膜的DNA或RNA结合，通过放射自显影等检测手段来判定膜上是否有同源的核酸分子存在[5]。

DNA探针是一种信号机制灵活、用途广泛等诸多优点的实用性探针，所谓实用，就是这种探针很容易合成而且性质稳定，而之所以该探针能达到那么好的效果，主要依赖于它所运用到的最重要的原理，这种原理涉及到一种在核酸的研究过程中很重要但也很基础的技术，称为分子杂交技术，DNA分子杂交技术常常运用于基因工程的领域，且效果良好，这里DNA探针也运用了这种技术。DNA探针的作用原理是探针与目标物质发生结合，结合而成的分子具有灵活的特质，另外这种探针与目标物的结合还具有特异性，从而会有非常灵活的细胞识别机制。DNA探针的应用范围非常广，首先它可以运用在医学领域，主要的作用是用来诊断各种疾病，比如可以诊断寄生虫病，可以用来诊断病毒性肝炎，可以用来研究致病真菌，可以用来诊断一系列遗传性疾病。其次在生活领域，DNA探针可以用来检测饮用水中病毒的含量，在检测水中病毒的应用当中使用DNA探针相较于传统的检测方法具有省时、精确、灵敏的优点；它还可以用来检测转基因植物产品。最后在化工领域，关于DNA探针的研究有许多，比如：其运用于检测汞离子及其络合剂；其运用于对转基因职务产品的检测；运用DNA探针的原理设计一种生物传感器，这种传感器可以用来检测致病物质，效果精确，这种生物传感器以后可以运用到比如基因研究、疾病诊断、卫生防疫、药物研究和生物等诸多领域。

总而言之，DNA探针应用广泛，且其发展空间非常广阔，具有快速准确，便捷可靠，成本低廉等诸多优点，在医学、环境、食品、化学研究等众多领域都前景广阔。

本文我的研究方向是合成一种DNA探针(DEAB-TO-3)用于实现细胞成像和DNA定量。

2.2 相关化合物的合成路线

2.3 实验部分

2.3.1 仪器与药品

实验中所用的主要药品如下所示：

表一 实验所用化学药品

续表一

实验中所用的主要仪器如下所示：

表二 实验所用化学仪器

实验中所用的表征仪器如下所示：

表三 实验所用表征仪器

2.3.2 合成步骤

2.3.2.1化合物1-乙基-4-甲基喹啉鎓碘化物的合成

首先称量5g 4-甲基喹啉和5.84g 碘乙烷，取一个100ml的圆底烧瓶，在烧瓶中加入大小合适的磁子，然后将称量的两种药品放入烧瓶中，再加入35ml甲苯，将油浴锅升温至110℃，然后将圆底烧瓶夹在铁架台上，一半多瓶体仅在由于国中搅拌加热回流8h，8h过后观察瓶内现象，将圆底烧瓶取出，冷却至室温，瓶底有绿色固体生成。将溶液超声，用乙醚洗涤抽滤，冲洗数次，抽滤20min，得绿色固体，将绿色固体置于真空干燥箱中干燥，得目标产物1-乙基-4-甲基喹啉鎓碘化物（6.37g，收率：61%）。

2.3.2.2 化合物1-乙基-4- [2-(苯基氨基)乙烯基]喹啉鎓碘化物的合成

称量6.37g产物1和4.18g N,N’-二苯甲脒置于100ml圆底烧瓶中，置于油浴锅中搅拌加热反应，加热至160℃回来30min，反应结束后将圆底烧瓶取出，冷却至室温，瓶底有深红棕色固体生成。将溶液超声，用乙醇洗涤抽滤，冲洗数次，抽滤20min，得到深红棕色固体，将深红棕色固体置于真空干燥箱中干燥，得目标产物1-乙基-4- [2-(苯基氨基)乙烯基]喹啉鎓碘化物。同时，将抽滤所得滤液重结晶，再抽滤，得目标产物为深红棕色固体（共4.12g，收率：48%）。

2.3.2.3 化合物1-(4-溴)-丁基-2-甲基苯并噻唑鎓溴化物的合成

称量5g 2-甲基苯丙噻唑和8.70g 1,4-二溴丁烷（1.2eq）置于100ml圆底烧瓶中，向烧瓶中加入5ml甲苯，将圆底烧瓶置于油浴锅中搅拌加热回流，升温至135℃反应2h，反应结束后将圆底烧瓶取出，冷却至室温。将溶液超声，用乙醚洗涤抽滤，冲洗数次，抽滤20min，得到灰色固体，将灰色固体置于真空干燥箱中干燥，得目标产物1-(4-溴)-丁基-2-甲基苯并噻唑鎓溴化物（1.25g，收率：20%）。

(4)化合物窗体顶端

窗体底端

2.3.2.4 化合物1-乙基-4-{3-[3-(4-溴)-丁基-2-苯并噻唑亚基]丙烯基}喹啉鎓碘化物的合成

称量550.80mg产物2和500mg产物3置于100ml圆底烧瓶中，配置13.7ml的1:1的CH₂Cl₂/CH₃OH溶液，加入圆底烧瓶中，再向烧瓶中加入1.369ml乙酸酐和1.369ml三乙胺，混合后将圆底烧瓶置于油浴锅中，温和地升温至35℃搅拌回流，反应30min，得到绿色溶液，将圆底烧瓶用铝箔包住，在室温和黑暗的状态下保存1.5h。将烧瓶取出，用乙醚抽滤，多次洗涤，抽滤30min，得到绿色固体，将绿色固体放置在真空干燥箱内干燥，得到目标产物1-乙基-4-{3-[3-(4-溴)-丁基-2-苯并噻唑亚基]丙烯基}喹啉鎓碘化物（0.413g，收率：51%）。

窗体底端

2.3.2.5 化合物1-乙基-4-{3-[3-(4-二乙氨基)-丁基-2-苯并噻唑亚基]丙烯基}喹啉鎓碘化物（DEAB-TO-3）的合成

称量0.413g产物4置于圆底烧瓶中，量5.8ml乙二醇甲醚加入圆底烧瓶中，再向烧瓶中加入0.508g二乙胺，置于油浴锅中加热搅拌，升温至135℃，加热回流6h，反应结束后，向圆底烧瓶中加入20ml乙醚，冷却至室温后放入冰箱中过夜。将圆底烧瓶取出，用乙醚抽滤，冲洗数次，抽滤30min，得到的固体用3/200的CH₃OH/CH₂Cl₂溶解。配置1%的CH₃OH/CH₂Cl₂做洗脱剂（洗脱剂甲醇浓度逐渐提高），取1ml溶解的溶液稀释作参照点，搭氧化铝柱子，进行柱层析，点板与原溶液对比，蓝色部分收集，蓝色部分即为目标产物1-乙基-4-{3-[3-(4-二乙氨基)-丁基-2-苯并噻唑亚基]丙烯基}喹啉鎓碘化物（DEAB-TO-3）（195.34mg，收率：21%）。

2.3.3 化合物表征测试方法

(1)核磁共振：取5-10mg待测物质微量置于锥形管中，加入对应的氘代溶剂，超声至固体完全溶解后，用移液枪将溶液吸取后注入核磁管中，确保溶液充分溶解，最后通过核磁共振仪进行氢谱碳谱检测判断是否为目标产物。

(2)液相色谱：样品制备同质谱分析，标记以后，用液相色谱仪进行分析。仪器先用甲醇冲洗20-30min之后，方可使用。观察峰形和出峰时间判断样品中是否有目标物质。

(3)质谱：称量经核磁表征过的化合物1mg，用相应溶剂溶解后，再取1-5µl到1ml甲醇中，配制成1-5ppm浓度的样品，进行质谱测试。

2.4 结果与讨论

2.4.1 实验数据处理

根据文献产率计算结果，理论产量分别为：

1=9.51g(91%) 2=4.12g(48%) 3=5.19g(83%) 4=0.518g(64%) 5=260.45mg(28%)

实际产量分别为：

1=6.37g 2=4.12g 3=1.25g 4=0.413g 5=195.34mg

由此计算各步产率结果为：

1产率=6.37÷9.51×91%=61%

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