论文总字数：18961字

摘 要

当前恶性肿瘤是全球直接危害人类健康的严重疾病之一。临床上使用的化疗药物大多数是细胞毒性类药物。这种药物存在对实体瘤疗效不佳、无选择性、毒性大等明显缺点。因此，急需寻找新型安全、高效低毒的抗肿瘤药物。

p53是一种非常重要的人类肿瘤抑制基因，它具有DNA修复、细胞周期阻滞、凋亡的功能。MDM2是1987年发现的致癌基因，其表达产物MDM2蛋白与p53蛋白结合后抑制p53的正常生物学功能，从而可导致肿瘤的发生和发展。

一般多肽药物代谢不稳定，进入体内后被蛋白酶迅速分解而失去活性，生物利用率低。另一方面，合成多肽很难保持其在生理条件下稳定的空间结构，从而失去其特定生物活性。通过大环化修饰来稳定合成多肽α-螺旋构象是提高其代谢稳定性与生物活性的重要手段，但现有大环化修饰方法难度大、效率低、成本高。

本课题设计了一种硫醚钉合α-螺旋多肽的合成方法，通过使用半胱氨酸替换模板肽链上相应位置的氨基酸并经硫醚成环的方法来锁定多肽的α-螺旋构象，系统研究半胱氨酸构型与替换间隔和替换位置、连接臂长度与刚性等因素对稳定α-螺旋结构的影响，从而建立一种新型的、简单高效的稳定合成多肽α-螺旋构象的修饰方法，然后应用这一方法对具有重要抗肿瘤生物活性的多肽进行结构修饰，研究修饰后的多肽的体外代谢稳定性、细胞透膜性及与靶点结合能力，探索这种新的修饰方法在多肽药物研发中的应用前景。这一工作将为合理设计构象限定的α-螺旋多肽药物分子提供理论指导和实验依据，为创制新型多肽药物提供新的方法与技术手段。

关键词：α-螺旋，钉合多肽，构象限定，抗肿瘤

目 录

摘 要 1

第一章 文献综述 4

1.1 肿瘤的概述 4

1.2 p53-MDM2与肿瘤发生发展的关系 4

1.3 小分子p53-MDM2结合抑制剂 6

1.4 多肽类p53-MDM2结合抑制剂 7

1.5 固相合成 8

1.6 Fmoc策略合成多肽......................................................................................9

1.7 课题研究内容和意义 10

1.7.1 研究内容 10

1.7.2 研究意义 11

第二章 实验设计....................................................................................................11

2.1 多肽结构改造设计 11

2.2 连接臂的设计 12

2.3 圆二色谱（CD）表征硫醚钉合α-螺旋多肽 13

2.4 硫醚钉合α-螺旋多肽的生物活性研究 13

第三章 实验部分 15

3.1 实验主要仪器、药品、试剂及基本操作 15

3.1.1 主要实验仪器 15

3.1.2 主要试剂 15

3.1.3 常用试剂的配置 17

3.1.4 基本操作 18

3.2 骨架线性肽的合成 20

3.3 连接臂的合成 22

3.3.1 连接臂2a的合成 22

3.3.2 连接臂2b的合成 22

3.3.3 连接臂2c的合成 22

3.3.4 连接臂2d的合成 23

3.3.5 连接臂2e的合成 23

3.4 多肽与连接臂发生硫醚钉合反应 24

3.5 多肽的圆二色谱（CD）实验 26

第四章 结果与讨论 28

4.1 多肽的纯度测定与结构鉴定 28

4.1.1 骨架线性肽的纯度与MS结果 28

4.1.2 相应连接臂修饰改造后的多肽纯度与MS结果 28

4.2 多肽螺旋度测定结果 28

4.3 实验讨论 29

4.3.1 多肽的合成条件优化 29

4.3.2 不同构型的半胱氨酸对螺旋度的影响 30

4.3.3 连接臂长度与刚性对螺旋度的影响 30

4.3.4 硫醚钉合中存在的副反应 30

第五章 结论与展望 31

5.1 结论 31

5.2 展望 32

参考文献 32

附 录 34

致 谢 48

第一章 文献综述

1.1 肿瘤的概述

世界卫生组织在2014年4月3日发表了《全球癌症报告2014》，研究称2012年全球癌症患者和死亡病例都在不断地增加，在世界新增癌症病例中，中国新增癌症病例高居第一位。中国新增病例和死亡人数在食道、肝、胃和肺4种恶性肿瘤中均排在世界第一位。

治疗肿瘤一直是医学界的重大难题之一。现今医学界对恶性肿瘤的治疗一般采用手术治疗、放射线治疗和化学治疗结合，免疫治疗，中医中药治疗等方法。临床上使用的化疗药物大多数存在各种明显缺陷，例如对实体瘤疗效不佳、毒性大、无选择性。因此，寻找新型的抗肿瘤药物就显得迫在眉睫。

1.2 p53-MDM2与肿瘤发生发展的关系

肿瘤是一种基因病。p53在人类肿瘤抑制基因扮演着极其重要的角色。其编码的蛋白质分子质量为53 kDa，因此得名为p53。其表达产生的p53蛋白能够执行肿瘤抑制功能。1987 年Cahilly-Snyder 等人发现MDM2（murine double minute 2）是一种致癌基因。MDM2的表达产物作为p53的一种重要的负性调节蛋白可与 p53 蛋白结合^[5]，并且抑制p53的正常生物学功能，从而导致肿瘤的发生和发展。

1989年p53第一次被确认为肿瘤的抑制基因，从此科学家们研究它的热度一直只增不减。到目前为止，已有大量关于p53的研究论文和综述发表。这些研究表明p53是一个有效的肿瘤治疗靶点。有两方面主要原因导致p53失活：一、 基因突变而失去活性，超过一半的人类肿瘤中都有突变型p53基因。二、由于部分肿瘤过度表达一些负性调节蛋白，这些蛋白与p53蛋白结合使p53失去活性^[4]。人类一半以上的肿瘤与p53抑癌基因的失活或突变有关。

p53蛋白是一种多功能的肿瘤蛋白，在DNA修复、细胞周期阻滞和调亡等许多细胞机制中起到了至关重要的作用^[6,7]。在低氧、热休克、DNA损伤等的致癌因子的诱导下，p53抑癌基因就会被激活，通过其他转录因子直接或者间接地阻止细胞生长，诱导细胞凋亡。一旦p53失活或缺失肿瘤就得到发生发展。

研究表明有13%的食道癌、10％的高分化神经胶质瘤和20%的软组织肉瘤中都有MDM2 的扩增，所以癌基因MDM2会在很多肿瘤中表现扩增现象。

1.3 小分子p53-MDM2结合抑制剂

药物化学家们根据p53-MDM2复合物晶体结构，模拟MDM2上的p53关键结合位点（hot spots）——第19位苯丙氨酸(Phe)、第23位色氨酸(Trp)和第26位亮氨酸(Leu)，在计算机上模拟设计能与之结合并且亲和力强于与p53结合力的MDM2抑制剂，抑制MDM2与p53的结合，恢复p53的抑癌基因活性，并利用“hot spots"这一结构特征合成了一系列小分子化合物。

这些小分子抑制剂大部分是模拟p53的3个关键性氨基酸残基与MDM2表面的三个疏水空腔相结合，从而竞争性与MDM2结合。这些小分子抑制剂主要可以分为：1、查尔酮类^[12]；2、苯并二氮卓类^[13,14]；3、咪唑啉（Nutlin）类^[15,16]；4、异吲哚酮类^[17,18]；5、降莰烷类^[19,20]；6、螺环骨架类^[21,22]；7、磺胺类^[23]；8、RITA^[24]；9、羟基喹啉类^[20]等（图1-8为代表性小分子p53-MDM2结合抑制剂）。

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