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一种新颖的生物陶瓷支架，将丝素蛋白聚集在多磷酸钙中，用于骨组织工程

摘要

生物陶瓷的生物相容性和骨传导的优点已被广泛用于骨修复和替代为骨组织工程材料。然而，生物陶瓷支架仍然需要改进以满足复杂骨修复的要求。本研究的目的是基于丝素蛋白（SF）和多磷酸钙（CPP）复合支架的组合，开发用于骨再生的新型生物支架。在本研究中，制备了Bombyx mori丝素蛋白（BMSF）和Antheraea pernyi丝素蛋白（APSF），并应用于戊二醛交联的CPP支架中，形成BMSF / CPP和APSF / CPP生物陶瓷。然后，这些支架经过强度试验，形态评估，生物降解和生物相容性评估。我们的研究结果表明，CPP型生物陶瓷在将丝素蛋白掺入CPP结构后表现出较高的抗压强度和增强的降解。此外，BMSF / CPP和APSF / CPP型支架比CPP和HA类型的细胞毒性低。考虑到改进的机械特性和降解以及可用性，SF / CPP可被认为是适用于骨组织工程的生物陶瓷。

1.介绍

在骨组织工程中，支架有助于骨发育和体内修复。对于修复骨缺损，脚手架的制造最近吸引了大量的研究工作。生物陶瓷已被广泛用作支架，特别是骨缺损修复。生物陶瓷的优点包括良好的骨传导，生物相容性和对骨组织工程的适当支架的贡献。 多磷酸钙（CPP）生物陶瓷是一种众所周知的骨修复和再生生物陶瓷，已经开发了十多年。 由于其公认的生物可利用性，可控降解性，可接受的生物机械性能和与天然骨骼的组成相似性，CPP引起了相当大的关注。 已经显示CPP支架在植入兔子股骨下肢之后支持骨生长而无不良反应。 这些发现表明CPP型支架具有潜在的软骨植入生物活性物质的潜力。

以前的研究已经探讨了聚合度对体外机械性能和CPP降解速率的影响。他们表明更大量的聚合与较高的压缩强度和降解的降解速率有关。 Wang等人指出，与模拟溶液（pH 7.4）相比，CPP在极端溶液（pH 3.0）中显示出不同的降解速率。在体内，骨替代材料应该是骨传导的，以便尽可能快地在宿主的骨骼内整合。此外，它必须以足够的速度生物降解，以便最终被新形成的天然骨替代。重要的是，CPP的降解水平已被证明是低的，这表明CPP支架可能不会补偿骨植入中的骨生长速度。以前的研究表明，锶掺杂的多磷酸钙表现出改善的降解行为，以支持体外成骨细胞的生长，并增加体内新的骨再生，然而，锶掺杂的多磷酸钙的机械性能仍然不能令人满意。因此，CPP型生物陶瓷需要进一步改善机械性能，以便紧密匹配天然骨的抗压强度。

生物陶瓷的机械性能可以通过包含天然衍生的聚合物如胶原蛋白，壳聚糖[14]和丝素蛋白（SF）进行调节。丝蛋白通常在上皮细胞生物合成后的专家腺内产生，随后分泌到这些腺体的内腔中，蛋白质在纺丝成纤维之前储存。蚕丝蛋白（Bombyx mori丝素蛋白（BMSF），Antheraea pernyi丝素蛋白（APSF）和丝素蛋白（SF））是蚕丝中最广泛的特征，由两丝丝蛋白丝组成，丝胶蛋白丝与丝胶蛋白胶粘在一起，单螺纹直径约10至25mu;m。由于其优异的生物活性，包括生物相容性，水蒸气渗透性，生物降解性和最小的炎症反应，近来广泛报道了SF在生物应用中的应用。通常SF与无机材料结合，产生具有改进的机械和生物学特性的混合材料。我们对这种材料的兴趣源于以前的研究，设计和开发了一种新型的骨修复支架复合系统，并且研究了性能因素。这项工作的目的是显示丝心蛋白/多磷酸钙（SF / CPP）组合物的制备。此外，我们试图调查其形态，结构和压缩强度，以及进行复合支架的体外生物活性评估。

2.材料和方法

2.1材料

四川大学提供A. Pernyi和B. mori蚕茧。得自Sigma-Aldrich Co.（St.Louis,MO,USA）的Triton X-100,聚（环氧乙烷）（PEO,平均分子量90万）和福尔马林溶液（中性缓冲液，10％）。从 Gibco TM（Carlsbad,CA,USA）获得胰蛋白酶，胎牛血清FBS）和Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（D-PBS,不含镁和钙）。 所有其他物质均为分析或药物级别，并自Sigma-Aldrich Co.

2.2三维丝素蛋白磷酸钙支架的制备

制备B.mori和A. pernyi丝纤蛋白溶液。

简言之，将蚕豆的茧在0.02M Na₂CO₃水溶液中煮沸45分钟，然后用蒸馏水彻底冲洗以提取胶状丝胶蛋白。然后将提取的丝素蛋白在78℃下溶解在CaCl₂ :CH₃ CH₂OH:H₂O（摩尔比1:2:8）溶液中2小时，得到20％w / v的溶液。在室温下，使用Slide-a-Lyzer（MWCO 3500,Pierce）在蒸馏水透析72小时期间除去溶液中的盐。透析液是在5℃下离心两次，每次20分钟，以消除整个透析过程中形成的聚集体和杂质。水性丝素蛋白的最终浓度约为3％w / v。该浓度通过称量残留固体得到在60℃下干燥24小时后的已知体积的溶液。如前所述制备多磷酸钙支架。将B. mori丝素蛋白和A. pernyi丝素蛋白溶液加入到CPP支架中，包括和排除戊二醛，并在室温下混合至少30分钟，以产生3％w / v丝素蛋白的最终湿组合物。将不同浓度（0.1％，0.3％，0.5％，0.7％和0.9％w / v）的戊二醛溶液包含在混合溶液中并搅拌5分钟，然后将其倒入培养皿中并冷冻20 1C。随后冻干（Heto LL3000冻干机，Alleroslash;d，Denmark）72小时。干燥后，称量这些制备的支架以计算干重的组成百分数。

2.3生物支架的傅立叶变换红外光谱（FTIR）

FTIR光谱仪用Spectrum One（Perkin-Elmer,MA,USA）进行。 将样品研磨成适当尺寸的颗粒，其中使用液压机将少量的颗粒密封成KBr颗粒（厚度为0.5mm）。 测量在环境温度下进行。在干燥吹扫空气下，以4cm^-1的分辨率获得光谱，并且对每个样品累积16次扫描。所有测试的IR光谱在4000-400cm^-1内获得。从每个样品的光谱中减去KBr光谱。

2.4 微观结构表征

样品使用具有CuKalpha;单色辐射的X#39;Pert Pro MPD（Philips,Netherlands）进行X射线衍射（XRD）。 为了表征两种样品的微观结构，采用20kV的加速电压进行扫描电子显微镜（JEOL JSM-5900LV,Boston,MA,USA）。线性截距法允许确定谷物的平均尺寸。

2.5 体外降解试验

如前所述，在体外进行降解测试。 简要地，分析材料（6个样品/组）的重量损失，流体离子浓度和压缩测试的速率。选择连续时间段（0，1，3，5，10，20和30天）作为降解间隔。将支架在50ml模拟体液（SBF）溶液中孵育。 在每个时间点，将支架在蒸馏水中冲洗，并在加压之前在50℃真空干燥。 重量损失的百分比通过使用以下等式确定：重量损失（％）frac14;（W₀ W_t）/ W₀ 100％，其中W₀是支架的初始重量，Wt是在时间t的干燥支架的重量。

2.6机械评估

如前所述进行抗压强度试验。简而言之，使用Instron 4302计算机化通用材料测试装置（Norwood,MA,USA）来发现抗压强度。在37℃下在SBF溶液中分别浸渍0分钟，1,3,5,10,20和30天之后，制备圆柱形样品（10mm直径10mm长度）。然后将它们在80plusmn;1℃下干燥24小时。施加每个样品0.1cm / min的加载速率以达到断裂点。进行每个负载的五个周期以测量其标准偏差的平均强度值。 压缩强度降低率通过以下方程式确定：抗压强度降低（％）frac14;（CS0-CSt）/ CS0 100％。 这里CS0是非干燥支架的初始抗压强度，CSt是在时间t的干燥支架的抗压强度。

2.7 细胞培养

ROS17 / 2.8成骨细胞系从ATCC购买。这些细胞的制备和脱水遵循作者以前描述的方案。扫描电子显微镜用于观察细胞在建筑层面的粘附和形态学特征。

2.8体外细胞增殖试验

进行细胞增殖研究以确定不同浓度的戊二醛溶液的细胞毒性。这证实了通过MTT（3- [4,5-二甲基硫杂环戊烷-2-基] -2,5-二苯基四唑溴化物）与丝素蛋白交联CPP支架的相容模式。确认戊二醛的浓度，并对CPP，BMSF / CPP和APSF / CPP支架进行各种材料表征方法，通过MTT研究细胞增殖的细胞毒性。在24小时（37℃）下取出圆柱形支架切片（10mm直径1mm长），并以每个盐溶液的0.75cm 2 / ml的比例置于盐水溶液中。在过夜培养之后，将4103个细胞/孔接种在24孔板中。将BMSF / CPP，APSF / CPP和CPP支架置于每个孔中（n = 5）。分别在第2,4和6天取出一系列板。将加入5mg / ml PBS的20mu;l/孔MTT混合物置于板中。将板在37℃下孵育另外4小时，由此将150mu;l二甲基亚砜（300mu;l/孔）掺入所有孔中并搅拌10分钟。每个孔的光密度（OD）值通过Micro-plate Reader（型号550，Bio Rad Corporation）在波长492nm获得。这有助于研究与其相对OD值成比例的细胞数。

2.9 统计分析

统计分析采用SPSS19.0（IBM，Chicago，IL，USA）进行。 本研究获得的研究数据为71个标准偏差（SD）。 测试组之间的差异通过单因素方差分析确定，显着性设置为0.05。

1. 结果

3.1丝丝蛋白支架

获得了FTIR和XRD，并在支持信息中描述了细节。 XRD和FTIR光谱分析表明，在丝素蛋白支架中观察到无规卷曲结构和beta;折叠结构。

3.2浓缩戊二醛与丝心蛋白交联支架

MTT检测是评估材料细胞毒性的重要方法。图1和图2显示了使用不同浓度（0.1％，0.3％，0.5％，0.7％，0.9％w/v）的戊二醛溶液与丝素蛋白交联CPP的细胞毒性结果。对于OD值，当戊二醛浓度增加到0.5％w/v以上时，细胞增殖下降。虽然显而易见的是，当CPP支架中加入小于0.3％w/v的戊二醛时，与对照组相比，细胞增殖率的变化值几乎没有变化，表明戊二醛用于交联CPP的浓度低丝素蛋白骨架无毒。此外，在后续研究中，具有CPP支架的丝素蛋白复合物在0.3％w / v的浓度下通过戊二醛交联。

3.3 SBF降解

图3说明了SBF溶液中所有支架的体重减轻变化。 尽管在该溶液中支架可能会降解，但每个体重减轻的速率是不同的。显然,减肥率遵循APSF / CPP4CPP4BMSF / CPP的趋势。 这包括对整个时期的暴力的所有测试。 所有支架在10天内快速释放，10天后支架的总体重量减轻略有增加。 有趣的是，APSF / CPP比CPP更快释放，而在相同浓度（3％w / v）的BMSF中掺杂的BMSF / CPP支架的体重减轻率在整个期间都低于CPP。

图.1.用不同浓度戊二醛与BMSF交联的不 图.3. SBF中三种支架的体外减肥曲线。同天数的CPP支架共培养的

ROS17 / 2.8增殖的MTT测定。

图. 2.与不同浓度戊二醛与APSF交联 图.4.在SBF中CPP，BMSF / CPP和APSF 的CPP支架共培养的 的抗压强度曲线。

ROS17 / 2.8增殖的MTT测定。

3.4. 脚手架的机械性能

在0,3,3,5,10,20和30天，SBF溶液中CPP，BMSF / CPP和APSF / CPP的抗压强度平均值见图1。不同支架之间的值差异很大。降解开始前第0天的抗压强度分别为1.8070MPa，2.0270MPa和2.4170MPa。SBF溶液降解1天后，所有支架的抗压强度明显降低至1.6270 MPa，1.8470MPa和1.7870 MPa; 对于CPP和BMSF / CPP支架，与APSF / CPP支架相比，抗压强度缓慢降低。 BMSF / CPP支架具有比APSF / CPP支架更高的压缩强度。

经过30天的SBF浸泡时间，脚手架的抗压强度不断下降。 CPP抗压强度降低率为86.1％，APSF / CPP为86.7％，BMSF / CPP支架的抗压强度从第0〜第30天为80.1％。APSF / CPP的抗压强度明显下降 由于SBF结构的迅速下降，而BMSF / CPP的抗压强度平稳降低。

3.5.微结构分析

图5显示了CPP，BMSF / CPP和APSF / CPP结构的SEM显微照片。具有三维互连孔隙度的预期结构是明显的。显微照片在BMSF / CPP（图5C）和APSF / CPP（图5E）的支架中显示出明显的非晶样区域。 CPP表面形态（图5A）似乎具有增加的密度和平滑度。在SBF溶液中降解30天后，在CPP支架表面观察到三维颗粒间隙和互连的微孔网络（图5B），说明了CPP支架的部分降解。 CPP和SF / CPP支架之间的主要差异是以1000倍大小的方式观察的。 SF / CPP的结晶微片似乎比CPP更松散。在SEM显微照片中，SF / CPP结构（图5D和F）显示了不同的非晶区和高度相互关联的大孔网络，支架不仅允许细胞生长和空间均匀分布，而且允许运输流营养物质和代谢废物。 CPP支架周围的BMSF（图5D）出现破裂，而CPP脚手架周围的APSF仍然连接到网络（图5F）。然而，在APSF / CPP结构中，明显的大孔区域是明显的，而BMSF / CPP的互连多孔网络表面结构更密集，均匀和规则。 BMSF / CPP与APSF / CPP

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