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微生物辅助高抗冲聚苯乙烯（HIPS）降解

摘 要

研究了新分离的假单胞菌和芽孢杆菌菌株降解溴化高抗冲聚苯乙烯（HIPS）的功效。通过三苯基四唑氯化物（TTC）验证了使用e-塑料作为唯一碳源时这些培养物的生存力。 HIPS乳液与芽孢杆菌属菌种孵育四天。的浊度降低了94％，假单胞菌属的降低了97％。通过HPLC，NMR，FTIR，TGA和重量损失分析得出降解的确认。降解膜的NMR光谱显示脂肪族碳链与溴的形成及其释放。样品的FTIR分析显示C-H，C = O和C = N组减少。溴化HIPS膜的表面变化通过SEM分析可见。用芽孢杆菌属物种降解。在30天内，HIPS薄膜的重量减少了23％（w / w）。

第1章 简介

塑料由于其广泛的用途而成为现代社会中不可避免的材料。塑料材料的主要成分是高抗冲聚苯乙烯（HIPS），它是聚苯乙烯和聚丁二烯的混合物，可以提高所得聚合物的强度。从塑料中释放出的有毒金属（例如铅，汞，镉，六价铬，钡，铍等）可以

导致中枢神经系统和周围神经，神经系统和呼吸系统的损害。哮喘性支气管炎，DNA损害和皮肤疣是与废物释放到环境中有关的其他副作用。焚化是使塑料材料融化并燃烧的主要技术。淘汰非贵重金属。被认为具有致癌性的二氧化物和呋喃

焚化过程中会大量释放到环境中。因此，在当前情况下，针对此问题的微生物方法可能是一个更好的选择。目前的研究涉及十溴化HIPS的微生物降解，这是有关这种电子塑料的首次报道。分离株显示更大

降低天然HIPS膜的趋势。通过分析塑料薄膜的结构变化，薄膜表面生物膜的形成，检测培养基中聚苯乙烯降解的中间体以及研究负责解聚的培养物的酶谱，研究了降解的速率和重力。

第2章 方法

2.1 高抗冲聚苯乙烯

带有十溴二苯醚和三氧化二锑的HIPS为CSIR-IIP提供的白色不透明小珠粒形式，将200 mg珠粒溶于10 ml氯仿中，然后将其倒入一个敞开的玻璃板中，制得薄膜。室温下在通风橱中过夜，以获得结构一致的薄膜。

2.2 HIPS降解的介质

在这项研究中，HIPS（20 mg / ml）是唯一的碳源，其降解是在含有0.01％酵母提取物的矿物培养基中完成的。 0.02％MgSO4 7H2O; 0.02％KH2PO4; 0.01（NH4）2SO4; 0.005％MnSO4; 0.005％ZnSO4; 0.016％K2HP4。培养物也生长在营养肉汤或琼脂上（消化消化液5 g l^-1，牛肉提取物3 g l^-1，NaCl 0.5g l^-1，琼脂0.16g l^-1琼脂）。

2.3 培养富集与分离

土壤样品是从提卢湾安塔普兰（Thiruvananthapuram）（西海岸的080 29rsquo;15” N760 57rsquo;9” E）的塑料垃圾场收集的。将样品收集在土壤表面以下5 cm的无菌容器中。然后采用富集培养法，将10 gm的土壤样品转移到以矿物培养基（95 ml），0.85％Na Cl和HIPS膜作为唯一碳源的锥形烧瓶中。在30℃，150 rpm下孵育14天。将5ml的培养上清液转移至带有塑料的45ml新鲜矿物质培养基中。此外，在矿物培养基上进行平板接种以获得纯培养物。

2.4 分离株的初步筛选

将从富集培养方法获得的生物和连续稀释液进行TTC分析。用Bushnell-Hass培养基（0.1％NH4NO3； 0.02％MgSO4 7H2O； 0.1％KH2PO4； 0.01％CaCl2 2H2O； 0.015％KCl）进行测定，并加入HIPS膜作为唯一碳源。加入碳作为碳源，以检查其降解情况，将等分试样的20 ul TTC加入5 ml培养基中，如果该生物能够在以HIPS为唯一碳源的培养基中存活，则电子传输链中的酶的生物会将无色的TTC转化为红色的三苯基甲酰胺。

2.5 基因组DNA的分离及分离株的鉴定

采用试剂盒法从该生物体中分离基因组DNA。16SrRNA测序采用通用正向27F（大肠杆菌位置8-27，5-AGA GTT tgtc TGG CTC AG-3）和反向1492R（大肠杆菌位置1510-1492，5-GGC TAC CTT GTT ACGACT T-3）16SrRNA引物。PCR条件为：94℃、55℃、72℃、3min各37个周期，PCR产物经1%琼脂糖凝胶溶解，kit纯化，测序，核苷酸序列与NCBI数据库比较。

2.6 HIPS膜定殖细菌生物量的估算

估计膜表面的蛋白质含量是确定细菌与膜粘附的一个很好的选择。定期从液体培养液中收集定植的HIPS膜样品，在5ml氢氧化钠中煮沸30min，在规定的培养时间后离心，分离小球和上清液。重复这些步骤，将获得的上清液汇集起来，通过布拉德福德试验估计蛋白质含量。

2.7 扫描电镜分析

选择菌株接种于250ml矿物培养基中，以表面灭菌的HIPS膜（1times;1cm）为唯一碳源。在30℃下以200转/分的速度培养30天。孵育后，用2%十二烷基硫酸钠（SDS）和蒸馏水对HIPS膜进行清洗，并风干，然后对HIPS膜进行扫描电镜（SEM）分析，检查其表面磨损情况。成像前，在氩气气氛中，在25m A和0.3mpa条件下溅射镀金。

2.8 残余HIPS干重的测定

用微生物在30℃下孵育30天后，回收HIPS膜，并用乙醇和蒸馏水对其表面消毒。然后将薄膜风干，取残余重量。使用以下公式计算剩余膜重量，

2.9 红外光谱

美国Nicolet公司，型号：Nexus-870ftir在4500-400cm^-1的频率范围内用于分析。对3000cm^-1范围内的C-H拉伸、600cm^-1范围内的C-Br拉伸、1340cm^-1范围内的C-H弯曲进行了评估。将降解膜的结果与对照非降解膜进行了比较。

2.10.热重分析

对HIPS膜进行热重分析，以检查用分离菌处理后和处理前HIPS膜的重量损失。采用美国TA型TGA Q50进行分析。温度范围调整在50至700°C之间。在铂盘中加热薄膜，并以50 ml min^-1的速率将氮气冲入盘中，这样做是为了减少因阻燃HIPS释放HBr而引起的腐蚀。

2.11.核磁共振分析

将HIPS薄膜溶解在氘化氯仿中，作为内标物进行核磁共振氢谱分析。所用波长为500mhz，氘化氯仿中的塑料膜浓度保持在0.01gm ml^-1。以HIPS膜与分离菌孵育后的HIPS膜为试验膜，未经处理的HIPS膜为对照。

2.12.高压液相色谱分析

含有接种生物和表面消毒HIPS膜的矿物培养基在30°C下孵育30天，然后去除细胞，并通过0.2 um滤纸过滤收集的上清液，然后进行高效液相色谱分析。以苯乙醛、氧化苯乙烯、1-苯基-1,2-二乙醇和2-苯基乙醇为标准品。采用LC溶液分析软件进行分析。所用探测器为光电二极管阵列，测量波长为紫外210nm。色谱柱为C18（Gemini NX 5u C18 110A，粒径150times;4.6mm，粒径5u），流动相为50:50乙腈和水。注射量保持在10ul，流速调节为0.6ml min^-1。

2.13.解聚酶测定

以pH 6.8磷酸盐缓冲液中的HIPS乳液（2mg ml^-1）为底物。为了进行反应，将3ml底物添加到1ml培养上清中。初始孵育在50℃下进行20分钟，第二组孵育在30℃下进行4天。在孵育前于650 nm处取初始吸光度，在相同波长孵育后取最终吸光度。计算了浊度的降低。

第3章 结果和讨论

3.1 HIPS降解菌的分离

采用连续稀释富集法从塑料覆盖区采集的土壤样品中分离培养物，以HIPS为唯一碳源，对两种分离物的活性进行了肯定性的响应。

3.2 菌株鉴定

从两株经TTC还原法筛选的细菌中分离到基因组DNA，经16srRNA测序鉴定为芽孢杆菌属，另一株为假单胞菌属塑料倾倒场。定性分析表明，芽孢杆菌对脂肪酶和酯酶均呈阳性，而假单胞菌对酯酶呈阳性。

3.3 总蛋白质含量估算

两种培养物均在营养培养基上培养至OD为0.6，100ul的培养物移入均匀大小（1times;1cm）的塑料切割的矿物培养基中。孵育完成，每隔一定时间，无菌回收塑料薄膜。由于HIPS膜是疏水性的，生物会附着在膜表面。回收的薄膜在氢氧化钠中煮沸，上清液进行布拉德福德分析。经过两天的初始延迟期后，第三天蛋白质含量急剧增加，第四天和第五天达到高峰，表明细胞粘附在膜上。

3.4 扫描电镜分析

未经微生物处理的HIPS膜表面平整光滑，经处理的样品表明，在切口附近和周围发现有生物定植，并形成凹坑和孔洞，表明降解。以前曾报道过其他聚合物，如聚（3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸）和聚乳酸。

3.5 干重的测定

HIPS薄膜在与生物体孵育后的失重率显示出相当大的薄膜损失。用分离菌处理后的HIPS膜回收风干称重，用芽孢杆菌处理后的HIPS膜失重率为23.7%（w/w），用假单胞菌处理后的HIPS膜失重率小于10%，未经处理的HIPS膜无失重。失重率与扫描电镜结果和生物膜总蛋白含量有关。

3.6 红外光谱

FTIR结果显示某些峰强度有明显变化。我们能够看到频率的降低，而不是频谱的变化。这种减少是在波数在1000到500cm^-1之间的区域观察到的，通常对应于C–X，其中X可以是任何卤素。由于我们的化合物是溴化的，所以可以假设HIPS中与溴有关的部分发生了变化。在1000-1500 cm^-1（C=C）、2500-3500 cm^-1（sp² C-H、sp³ C-H）时，观察到类似的峰降低。

3.7 热重分析

通过重量分析比较了对照膜和处理膜的失重模式与温度的关系，得到的对照膜的热谱图呈均匀分布的曲线，生物降解后的HIPS膜的热谱图有明显的变化。报道指出，通过热重分析可以测定不同挤出工艺制备的高抗冲聚苯乙烯纳米复合材料的热稳定性。

3.8 核磁共振分析

以氘化氯仿为内标物，对生物降解前后的HIPS样品进行了NMR分析。与对照组相比，几乎没有新的高峰出现。其中一个主要的峰出现在3到4ppm之间，通常对应于-CH2 Br-。与对照组相比，在同一区域内没有该峰的踪迹。因此，可以得出结论，由于微生物的攻击，溴以甲基溴的形式从HIPS中释放出来。在电子废物焚化过程中，向环境中释放溴本身可能是一种潜在的健康风险。因此，以受控的生物方法处理溴化塑料总是更好的。

3.9 高压液相色谱法

聚苯乙烯对微生物的降解会导致许多中间体的形成，其中一些即将被发现的中间体是苯乙烯氧化物、苯乙醇、苯乙醛、1-苯基-1,2-乙烷二醇。得到的色谱图显示了其中一些中间体的存在。用芽孢杆菌和假单胞菌处理的培养基显示苯乙醇的存在。Fig.S5C示出了用峰“a”表示的苯乙醇标准品的色谱图。

3.10.解聚酶测定

用假单胞菌和芽孢杆菌培养上清液处理塑料乳液，浊度去除率分别为97.4%和92.6%。作为对照，采用热处理培养滤液，未观察到浊度清除，表明解聚酶的催化活性。

第4章 结论

这项研究证明了新分离培养物对溴化HIPS降解的潜力。一个可行的生物处理过程，利用一个选定的微生物联盟来处理塑料，可能是一个有前途和挑战性的工作，以进一步开展。

第5章 致谢

这项工作是由新德里CSIR根据第十一个五年计划网络项目W2W提供资金支持的。与本文相关的补充数据可以在在线版本中找到，http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2016.03.021.

参考文献

【1】 Allen, N.S., Barcelona, A., Edge, M., Wilkinson, A., Merchan, C.G., Quiteria, V.R.S.,2004. Thermal and photooxidation of high styrene butadiene copolymer (SBC).Polym. Degrad. Stab.

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