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兼有异养硝化-好氧反硝化性能的粪产碱杆菌的脱氮能力研究

摘要：4号粪产碱杆菌同时具有异养硝化和好氧反硝化的能力。在不同培养条件下的氮平衡中，被去除的NH₄ -N中，约40-50%通过反硝化作用转化为硝酸盐，其余约一半转化为胞内氮。在大约1200 ppm的高浓度NH4 -N、碳氮比为10：1、曝气条件下进行的分批实验中，4号的最大氨去除率及反硝化速率比同批具有相同功能的菌株高5-40倍。被除去的NH₄ -N中只有很少量转化为氮气，由此推测4号粪产碱杆菌的反硝化过程中产生的羟胺，是通过氨氧化产生的。

关键词：异养硝化，好氧反硝化，粪产碱杆菌，高浓度氨氮

传统的污水脱氮过程包括好氧条件下自养菌的硝化(NH₄ →NH₂OH→NO₂–→NO₃^–)和厌氧条件下异养菌的反硝化(NO₃^–→NO₂–→NO→N₂O→N₂) ^[1]。这个系统存在的问题如下所述：（i）硝化步骤非常慢；（ii）自养生物难于存在于高负荷氨和有机质中；（iii）这个系统需要一个好氧池和一个厌氧池。由于自养细菌的生长速率缓慢，因此处理浓度约为1000-3000 ppm的高浓度氨氮废水时，所需处理设备的规模很大。

最近，有异氧硝化和好氧反硝化功能的细菌(如假单胞菌、施氏假单胞菌、泛养硫球菌、从毛单胞菌、粪产碱菌)已经作为有前景的微生物被广泛研究，从而能克服传统方法存在的问题^[2]。迄今为止，对异氧硝化和好氧反硝化的研究集中在生活废水中存在的低浓度氨氮，并且关于处理高浓度氨氮的研究还很少^[3]。

4号粪产碱杆菌是在实验室中从污泥中分离出来的并对植物病原真菌Rhizoctonia solani K-1通过异氧硝化作用产生羟胺的过程起到抑制作用的细菌。在本研究中，我们通过改变碳氮的来源、碳氮比、培养温度和一批实验曝气速率研究了4号菌的高效除氮特性和通过氨氮平衡得到的除氮特征分布。

1.材料和方法

1.1微生物

4号粪产碱杆菌储存在温度为-80摄氏度的25%甘油溶液中。

1.2培养基

以介质合成废水为主要媒介的培养基主要是14 g K₂HPO₄ ，6 g KH₂PO₄ ，17 g 柠檬酸三钠，2 g (NH₄)₂SO₄，0.2 g MgSO4·7H2O，,2ml微量元素溶解在蒸馏水中。每升微量元素中包含下列组分57.1 g EDTA4钠，二钠盐，EDTA2钠，3.9 g ZnSO₄·7H₂O，7 g CaCl₂·2H₂O，5.1 g MnCl₂·4H₂O，5 g FeSO₄·7H₂O ，1.1 g (NH₄)₆Mo₇O₂4·4H₂O，1.6 g CuSO₄·5H₂O和1.6 g CoCl₂6H₂O(PH=6.0)。确定可用的4号菌的数量，L培养基包含1%蛋白胨，0.5% NaCl，0.5%酵母提取物，1.5%琼脂（PH值7.0）^[4]。

1.3摇床培养实验

在基本培养基中，可用五碳化合物，乙酸钠（缩写为醋酸介质），葡萄糖，蔗糖，果糖和甲醇作为碳源代替柠檬酸钠。硝铵、氯化铵和磷酸铵作基础培养基的氮源而不是硫酸铵。基本培养基（150 ml）通过0.2微升PTFE过滤膜（JPO20;Advantec,东京）放置在一个500 ml摇瓶中，将预培养的菌液按1%接种，30摄氏度，120 r/min培养60小时。定期取2 ml进行化学分析，并测量PH值和细胞密度。碳源和氮源的数量被改变来适应5、10和20的碳氮比。为了观察培养温度和摇动速度在除氮中的影响，温度分别设置为20 ℃、30 ℃和37 ℃，摇晃速度设置为90 r/min,120 r/min和150 r/min^[5]。培养时间根据培养条件不同为32-90 h。最初的氨氮浓度调整为100 mg/L，400 mg/L，1200 mg/L，三个浓度分别代表低、中、高铵负载。在硝化作用中发现三种氮源羟胺、亚硝酸盐、硝酸盐的消耗用于4号菌除氮机理的阐明。羟胺、亚硝酸盐、硝酸盐相应地分别调整为120、150和300 ppm N。对于每一个化合物，改变柠檬酸作为碳源的数量用以调整C/N为10：1。

一个含羟胺，亚硝酸盐和硝酸盐的150 ml的薄膜过滤基本培养基被放入到一个500 ml摇动烧瓶中，另加入7.5 ml预培养的4号菌液，30℃120 r/min培养16小时^[6]。

4号菌的分批曝气培养被用来检测除氮特性在有不同铵浓度的50 ml锥形瓶中。360 ml的薄膜过滤基本菌液放入锥形瓶中，4号粪产碱菌按照1%接种量接种，空气按照恒定风速5 ml/min通过一个烧结的空气喷布器由压缩机提供，培养是在电磁搅拌器下每分钟转数300.废气中的氮氧化物（包括NO和NO₂）含量用氮氧化物分析器(AP1 200A Type Analyzer; Riken Keiki, Tokyo)来检测^[7]。定期的取2 ml培养液进行化学分析PH和细胞密度的测量。由曝气反应器去除的氨在35 ml H₂SO₄中被吸收。分析方法是在离心机中10000转数离心经过膜过滤器过滤。NH₄ 的浓度、氮化合产品（羟胺、NO₂^-和NO₃^-）、脱氮产品和柠檬酸测定如下：NH₄ 用淀粉(JIS K 0102, 134-145, 1986)检测，羟胺用分光光度计(UV-1200; Shimadzu, Kyoto)检测。NO₂^–、 NO₃^– 和柠檬酸盐用离子色谱法(HIC-6A; Shimadzu)检测。NO和NO2用氮氧化物分析器来检测。液体培养基的光密度用分光光度计(UV-1200; Shimadzu)在600 nm下检测。氮含量和细胞密度的关系从干细胞的电化学分析中得到。这些干细胞是在离心和用无菌水洗涤后再105 ℃在干燥24 h得到的。在L琼脂培养基中测定活细胞的数量，脱单率用来定义氮的去除量与脱氮产品的比率。NO、NO₂和去除的铵只能在分批充气试验中检测。摇床和曝气培养基中的氮去除率只能通过铵浓度最大斜率的改变来测量^[8]。

2.结果与分析

不同碳源和氮源的除氮培养基的摇床培养模式用摇床培养基测定。当柠檬酸或醋酸作为碳源添加时，440 mg/L, NH₄ -N在39 h或45 h内可以完全除去。其它碳源，如葡萄糖、蔗糖、果糖和甲醇则不能被完全利用。不同铵盐如硫酸盐、氯化物、硝酸盐和磷酸盐能够以相同的速率除去（数据未显示）。在以柠檬酸盐和醋酸盐为介质中的氮平衡在表1和表2中显示。在柠檬酸中，48%的铵（204 ppm）转换为细胞团块，1%（3.88 ppm）转换为硝化作用的产品，因此51%被好养反硝化作用除去。在醋酸介质中，3%（11.3 ppm）的去除铵转化为硝化作用的产品，39%被好养反硝化作用除去另58%被4号粪产碱菌吸收。这些数据表明，在柠檬酸中的脱单率比在醋酸介质中好。在醋酸的氮平衡中估算出的脱单率包含不同的铵盐范围从38%到48%（数据未显示）^[9]。

2.1不同碳氮比条件下的氮去除率

不同碳氮比对于震荡培养的氮去除率的影响在图表1中显示。在基本培养基中（图1 a，B）最初包含360 mg/L NH₄ -N，NH₄ -N在10：1或20:1的碳氮比下能被完全消耗，但是在碳氮比为5的时候，NH₄ -N的消耗就停止在120 ppm主要是因为碳源的匮乏。在碳氮比为10:1的时候，柠檬酸和NH₄ -N的消耗率是相均衡的，几乎是同时变缓慢的。4号粪产碱菌的最后细胞浓度和碳氮比相对应，能够反映不同的碳浓度^[10]。

在醋酸介质中（图1C.D）碳氮比为10:1的时候，4号粪产碱菌的增长和NH₄ -N的消耗的模式和基本培养基中的是一样的。然而，在碳氮比为20时，在一个短暂时间内，NH₄ -N的消耗速率加快到碳氮比为10:1的时候，但是增长被推迟^[11]。碳氮比为5:1时，在24 h时增长趋于平稳而此时有40%的NH4 -N残留。这些数据表明，4号粪产碱菌利用或转换NH4 -N是在增长阶段并且碳氮比为10：1 时最好的生长条件。在两种介质中不同碳氮比下的氮平衡显示在图1中。当碳氮比为5:1时，培养基中NH4 -N的去除率只有60%，但是硝化率达到62%。碳氮比为10：1或20:1时，脱氮速率几乎是一样的。在醋酸盐培养基中，碳氮比为5:1时44%的脱氮率比碳氮比为10:1时35%和碳氮比为20:1时27%的脱氮率要大，但是硝化率在醋酸介质培养基中相对较低。脱氮似乎优先发生在低碳氮比条件下，但在较高碳氮比的条件下，在碳源充足而铵浓度较低条件下，氮源用于细胞合成和硝化作用^[12]。

2.2不同的温度和震荡速度下的氮去除率

人们已经研究了4号粪产碱菌在不同温度下的除氮特性。30 ℃和37 ℃下的除氮模式是一样的，但是在20 ℃条件下，有一段长时间的除氮停滞期被观察到。此后，氮去除率和在别的温度条件下是相同的。因此，通过最大斜率计算的37 ℃，30 ℃和20 ℃条件下的最大氮去除率大致是相同的，分别是25.2、24和26.4 mg-N/L/h。4号粪产碱菌在30 ℃和37 ℃下的生长模式是相似的，但是20 ℃下的增长速度就相对缓慢的多（数据未显示）。图表1中显示消化率在30℃比在20 ℃和37 ℃时大。

震荡速度对于除氮效果的影响也早就有所研究。在120 r/min和150 r/min时，获得完全的去除率需要36 h。然而，在90 r/min时，氮去除率显著降低，及时震荡时间超过60 h也不能达到完全的去除率。90 r/min时最佳的氮去除率是3.39 mg-N/L/h，在150 r/min和120 r/min的氮去除率分别是25.3 mg-N/L/h和23.5 mg-N/L/h。硝化率也在图表1中显示，在90 r/min明显缓慢。这说明，氧气的供应变化在氮去除和硝化作用中比温度变化更为重要。

因为氮去除率在30 ℃和37 ℃，在120 r/min和150 r/min时没有明显不同，所以30 ℃和120 r/min被用于后续的实验。

2.3高浓度氨氮条件下除氮

在碳氮比为10：1时，中等氮负荷和高等氮负荷下氮化合物和柠檬酸浓度的变化显示在图2中。中等氮负荷下的NH₄ -N的最佳去除率和高负荷下的NH₄ -N的去除率分别是23.6 mg-N/l/h和26.1 mg-N/l/h。羟胺的浓度在中等氮负荷时24h时达到最大，在高浓度负荷下48 h时达到最大，之后就开始减少。在羟胺开始生成时，亚硝酸盐和硝酸盐的浓度开始增加，继续增加，成平稳状态，然后观察这两种物质的 浓度并没有降低。柠檬酸和NH₄ -N的浓度的降低是相均衡的，这表明碳源和氮源是以均衡的速度被消耗的。

图1列除了中等负荷NH₄ -N和高浓度NH4 -N下除氮的氮平衡。NH₂OH-N,、NO₂^–-N 和 NO₃^–-N的浓度分别是2.3、3.8和11,1和9.9、5.0和12.8 mg/L。脱氮率在两个不同浓度负荷下没有明显不同，分别是44%和48%。在两个负载下硝化产品的总量仅有除去氮的3-4%。细胞内氮的数量占除去氮的49-52%。这表明，4号粪产碱菌去除的NH4 -N主要用于脱氮和吸收产物，即使是在中等氮负荷和高浓度负荷下也不用于硝化。

分批充气式培养。在观察到4号粪产碱菌可以在120 r/min的培养基中将去除氮转化为好养反硝化产品后，一个提供充足氧气的分批式充气装置就被用来研究4号粪产碱菌在碳氮比为10：1时，不同初始NH<s

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