英语原文共 5 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

脲酶筛选及其在水体重金属领域应用

李萌，程晓辉，郭红仙

^a清华大学土木工程学系,北京100084,中国公关

^b北京工商大学,北京100048,中国公关

摘要：微生物可以通过生物矿化来调解矿物的形成。这就对削减无机污染物提供了一种有效的方式,包含重金属在相对稳定的固体阶段。在这项研究中调查微生物的矿物沉淀的主要机制。在研究过程中使用了缩微实验的方法，通过镍、铜、铅、钴、锌和镉六种耐蚀金属细菌菌株来研究它们的生物矿化。这些细菌从苗圃土壤中分离，意味着他们有生物除污的潜在应用。这些细菌可以生产水解尿素的尿素酶。由于这种酶反应使土壤pH值增加、碳酸盐生产,导致可溶性重金属离子在土壤水分中成矿，并最终转化为碳酸盐。88%到99%不等的重金属成矿48 h后，选中的细菌显示出了高迁移率。扫描电子显微镜和x射线衍射分析表明,当pH值为8或9时，可观测到沉积在细胞膜周围的菱形、球形和针形重金属离子形成结晶碳酸盐矿物。本研究表明,固有的细菌可以从毒性重金属土壤和污水以及隔离可溶性重金属矿物中存活,这些细菌可以在重金属生物除污中发挥重要作用。

关键词：生物矿化、重金属、细菌、脲酶、微生物诱导、碳酸盐沉淀

1. 简介

自然界中，大多数重金属(如铜、镍、锌)低浓度地存在于土壤、岩石、水、生命系统和生物群中,足以提供必需营养素,但是其过高时会变成毒性。自工业革命以来, 通过工业废水排放、垃圾填埋、采矿活动、 农业中化肥和农药的使用、化石燃料的浪费和燃烧、城市垃圾等活动，重金属已成为环境中非常普遍的污染物。一旦这些重金属释放到环境中,它们不能被降解,并将积累在环境食物链中。重金属通过饮用水或食物的摄入可以在植物、动物和人类中积累。目前传统的处理土壤重金属污染和废水的方法,如化学沉淀法、离子交换法和吸附法都成效不佳或不经济。

源自矿物的细菌能引发金属离子的沉淀过程是普遍存在的，在重要的生化循环中，它是做为一个基本组成部分的。碳酸盐沉淀是生物矿化的一个重要方面, 由于其广泛的技术含义，现已经有了很广泛的研究。与无机矿物相比,生物矿物往往有自己的特定属性，其包括独特的大小、结晶度、同位素和微量元素成分。由细菌使碳酸盐矿化的应用程序包括通过浸出生产仿生材料和生物除污、无机污染物的固相捕获或堵漏粘结岩石和其它多孔介质裂缝。微生物诱导碳酸盐沉淀(MICP)已被证明是一个用来捕获放射性核素和微量元素污染物的有效的方法，如地下水中的锶(Sr)和钡(Ba)。

有许多导致碳酸盐的沉淀的微生物过程。目前,很多研究专注于尿素的水解酶。脲酶(尿素水解酶;EC3.5.1.5)是常见的各种各样微生物的分泌物。一摩尔的尿素水解得到一摩尔的氨根和一摩尔碳酸盐,自发水解额外形成一摩尔的氨根和碳酸。这些产物随后在水中平衡形成碳酸氢盐和两摩尔的铵离子和氢氧根离子。氢氧根离子使pH值增大,进而可以改变重碳酸盐平衡使碳酸根离子形成，这种转变可以沉淀废水或土壤中的重金属离子。

目前研究的目标是进行初步评价在废水或土壤中的微生物水解尿素能力和通过结合生物尿素水解沉淀直接去除重金属的能力。

1. 材料和方法

2.1离析

从中国北京的清华大学苗圃土壤中分离出了脲酶制造的细菌菌株。把该样品悬浮在无菌水上,适当稀释, 平铺在尿素测试平皿上。依据媒介颜色从黄色到粉红色的变化来对菌落选择，通过重复划线来进行纯化。

2.2菌株和培养基

巴氏芽孢八叠球菌属菌(ATCC11859)来自美国典型菌种收藏馆。肿大地杆菌(AS.1.2690)来自中国普通微生物菌种保藏中心。

所有菌株培养在NH₄-YE介质中,包括以下:酵母提取物20g/l;(NH₄)₂ SO₄10g /l。所有的媒介都是在121℃下热压处理过20分钟的，所有菌株在30℃和200rpm下培养。

2.3测量光密度(OD600)和脲酶活性

实验过程中,培养细菌的光密度测量在600 nm用作生物量浓度的指示。

取样后立即测定脲酶活性。在缺乏钙离子情况下,脲酶活性是由导电率决定的。脲酶反应涉及非离子酶作用物尿素到生成为离子产物的水解。它能在标准条件下相应提高电导率。1mL细菌悬液添加到9mL的1.11Mol^-1的尿素中，在25℃记录相对电导率变化(mS cm^-1 min^-1)至少5分钟. 一单位的脲酶活性被定义为1mM尿素每分钟水解的量。在活性的测量范围内,我们mS cm^-1 min^-1的测量值和11.1M尿素水解活性相关。

2.4提取DNA、16Sr RNA的PCR扩增、DNA测序和序列分析

根据厂家使用说明，通过基因组DNA净化设备中提取总基因组DNA来制得聚合酶链反应的DNA模板。16S rDNA通过含引物的PCR分离出的细菌来扩增，其引物具有27F（5rsquo;-AGAGTTTAGGATCCTGGCTCAG-3rsquo;）和 1492R （5rsquo;-GGTTACCTTGTTACGACTT-3rsquo;），它们分别在下列条件中: 在95℃下4分钟,接着是1分钟在94℃运行30个周期,50度下维持1分钟,保持72℃1分钟,接着72℃保持10分钟。通过电泳3%磷酸-乙酸-EDTA(TAE)凝胶，使得10毫升的PCR产物含有1.0%的琼脂糖凝胶。DNA和溴化乙锭染色，通过BINTA 2020 UV透照和Gel-Peo分析仪软件可视化。基因产物纯化,并在pMD18-T载体里克隆，由宝生物工程(大连)有限公司测序。序列与基因库中可获得的基因通过BLAST分析进行比较。序列相似性大于97%的被分组到一个操作分类单位进行分析，使用MG4.1来构建树状结构。核苷酸序列报道称，它们都存放在基因库里编号为JN393848-JN393851的基因上。

2.5重金属沉淀实验

对每个在室温下进行48小时的实验来说，沉淀的解决方案分别包含了1mL培养液、0.5 M尿素和2 g / L NiCl₂、CuCl₂、PbCl₂、CoCl₂、CdCl₂。挑选效果最好的细菌用来分析各种重金属的沉积速率。

2.6通过电感耦合等离子原子发射光谱分析法测量镍、铜、铅、钴、锌和镉

在水溶液中用电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）发射光谱仪II系列(美国热电元素公司)来测定镍、铜、铅、钴、锌和镉。

2.7环境扫描电子显微镜(ESEM)

在用环境扫描电子显微镜（ESEM）发射误差指示器设置为10至20 kv使用的试验研究过程中产生的沉淀进行了直接检测和元素分析。

2.8x射线衍射(XRD)

对于沉淀的x射线衍射(XRD)来说,材料是手磨和安装在玻璃载片上。样本进行D/max-IIIADIFFRATOMETER（日本理学电机公司）方面的检验。水晶阶段被确定使用在ICDD数据库(JCPDS)。

2.9耐酸性测试

一系列不同的pH值下的溶液是为测试沉淀重金属的耐酸性而准备的。其pH值从0.5到5.5间隔为0.5。先用一滴pH值为5.5稀盐酸溶液滴在沉淀物上，然后用一个放大镜仔细观察反应2分钟，看沉淀物是否出现了气泡。如果没有气泡出现,则可以得出结论,在这个pH值下沉积重金属可以抵制HCl溶液的腐蚀。然后降低盐酸溶液的pH值，滴在相同的沉淀物上，直到气泡生成，对应某一pH值下,而沉积层的耐酸性值为前面的pH值。

1. 结果与讨论

3.1离析和初始脲酶分析

因为尿素水解的产物，尿素平皿被用于以粉红色为依据来鉴别选择阳性菌株。约10%的菌落与苗圃土壤分离，当它们加深测试平皿的影响时或在液体测试培养基中生长时，会产生一种阳性脲酶颜色。高脲酶活性的区域呈现出大的红带被转移到NH4-YE琼脂媒介中。纯的菌落在摇瓶发酵对脲酶生产进行评估,而NH4-YE介质被用于选择阳性菌落。通过生物量、脲酶活性和比活性选择阳性隔离群。脲酶活性最高的四个隔离菌群被命名为UR31、UR41、UR47、UR53。此外,报告称这个研究测试巴氏高脲酶活性菌株S型杆菌和T型节杆菌的去除重金属能力。这些病毒菌株的生物量和脲酶活性测定(如图1)。

图1 在相同条件下栽培的不同菌株的生物量和脲酶活性图

3.2细菌的鉴定与排序

四个隔离群通过16rRNA来鉴定和测序。结果表明,他们彼此密切相关以及培养细菌属于芽孢杆菌和芽孢八叠球菌。BLAST结果表明,这一群体的近亲为UR31、UR41、UR47、UR53。构建了系统发育树状图，并显示在图2。

图2 系统发育树状图

3.3重金属溶液化学变化

在引进菌株到含有尿素的重金属溶液里,重金属的去除率高, 其在孵化的48小时后从88%到99%不等。UR47对铜和铅表现出的去除率最高,UR31对钴、锌表现出的去除率最高，T型节杆菌对镍和镉表现出的去除率最高(如图3)。这些细菌被用在另外一个研究中来检验单个重金属的沉淀过程。

图3使用分离菌株对各重金属的去除率图

重金属沉淀过程中，前20分钟pH值增加大约到9。实验超过48个小时，重金属浓度降低。在前2个小时，这些重金属离子的溶液浓度急剧下降，剩下的时间里浓度大概都相同的（如图4)。已知微生物参与了金属的解毒转换,比如六价铬转化为三价铬。

3.4沉淀的ESEM和XRD分析

在反应器中形成的固体样品进行ESEM检测，各种重金属晶体都表现出了不同的形态。在细菌分解尿素的过程中产生的沉淀大都是菱形、球体和针形的,一般都在10-50毫米大小。从图5(a,d)中可以看出镍和钴的沉淀主要是大约10-40毫米的菱形。图5(b,f)中的铜和镉的化合物主要显示出是球形，其晶体的小于镍和钴的晶体大小，球形颗粒为5-10毫米大小。如图5(c,e)所示，铅和锌的化合物为针状的,其大小为20-50毫米。沉淀的XRD分析表明其分别存在碳酸锌、碳酸铜、碳酸铅、碳酸镉、碳酸镍和碳酸钴。以前也研究过位于细菌的细胞内的镉沉淀物。

图4 各金属去除率图

（）T型节杆菌里的镍；（）UR47里的铜；（）UR47里的铅；（x）UR31里的钴；（*）UR31里的锌；（）T型节杆菌里的镉

图5 环境扫描电子显微镜图

（a）T型节杆菌里的镍；（b）UR47里的铜；（c）UR47里的铅；（d）UR31里的钴；（e）UR31里的锌；（f）T型节杆菌里的镉

3.5耐酸性

每种重金属沉淀的耐酸性几乎是不可微分的。他们耐酸性的pH值高于1.5。他们的耐酸性值为2.0。在环境中酸雨的pH值为3.5-5.6。因此,重金属沉淀在某种程度上可以抵御酸雨的侵蚀。

1. 致谢

在这项研究中,实验室测试表明,重金属污染物,如镍、铜、铅、钴、锌和镉可以通过细菌脲酶沉淀。从土壤中分离出的不同菌株的尿素分解功能，可以分析和高效调解不同重金属污染物的原位沉淀和抵制酸腐蚀。实验结果表明,细菌可以通过改变矿物晶体来转变重金属离子,这可能在去除废水和土壤中重金属发挥作用。

1. 参考文献

[1]Cheung, K.H., Lai, H.Y., Gu, J.-D., 2006. Membrane-associated hexavalent chromium Microbiology and Biotechnology 16, 855-862

[2] Cheung, K.H., Gu, J.D., 2007. Mechanisms of hexavalent chromium detoxification by bacteria and bioremediation applications. International Biodeterioration amp; Biodegradation 59, 8-15

[3] DeJong, J.T., Fritzges, M.B., Nusslein, K., 2006. Microbially induced cementation to control sand response to undrained shear.

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[151380]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word