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碳源对聚磷菌混合培养过程中生成的聚羟基脂肪酸酯（PHA）的影响

P.C.Lemos,C.Viana, E.N.Salgueiro, A.M.Ramos,

J.P.S.G.Crespo, M.A.M.Reis

摘要

在目前的工作中，人们关注的是不同的碳源和它们的浓度如何影响通过聚磷菌产生的PHA。用乙酸盐，丙酸盐，丁酸盐作为碳源进行独立测试。发现所用的碳源不同，生成的聚合物的组成也不同。乙酸盐作为碳源则3-羟基丁酸（HB）共聚物和带有羟基丁酸的戊酸（HV）的生成占主导地位。使用丙酸盐，主要生成戊酸（HV），只有少量的羟基丁酸合成。当使用丁酸盐，所形成的聚合物的量要比羟基丁酸生成的量低得多。每消耗相同的碳源量（Y_P/S），就会发现聚合物的产量从乙酸盐作为碳源（0.97）减少到丙酸盐作为碳源（0.61）减少到丁酸盐作为碳源（0.21）。用乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐的混合物来增加碳浓度，尽量保持每个基板的相对稳定，因主要消耗丙酸盐，PHA在戊酸酯（HV）中富集合成，在所有的实验中得到聚合物是当羟基丁酸含量较多时得到的相对分子量比较高的共聚物。合成的聚合物被发现是同类型的并且相对分子质量相当，这和商业上可用的消息有同等的价值。

关键词：聚羟基脂肪酸酯；聚合物表征；生物除磷；活性污泥；碳来源

简介

以工业和农业活动产生的含硝酸盐和磷酸盐废水导致水的河流和湖泊富营养化。研究表明微生物在厌氧/好氧循环条件下对废水脱氮还能够同时去除过量磷，这些微生物，称为聚磷菌，它能够存储的磷酸盐干重高达10%。通过除磷菌，磷酸盐可以同时去除^[1]。在最近几年中，相比化学除磷法，这个方法已经获得了更大的突破。生物除磷的优点是污泥产量低和污泥的肥料价值高。全球范围内几个工业处理厂正在使用这个生物除磷方法^[2]。

引言

聚磷菌代谢尚未完全阐明。已了解到这些细菌在厌氧条件下可以吸收短链脂肪酸，从而生成聚羟基烷酸酯（PHA）同时磷被释放到外部介质。这个过程需要的能量来源于细胞内多聚磷酸盐分解；还原当量的需要来源于糖原损耗和三羧酸循环底物降解^[3]。在好氧阶段的过程中，之前厌氧状态生成的的PHA被用于初期代谢物和微生物的生长^[4]。产生的能量的一部分用于从外部介质吸收含磷酸盐的多聚磷酸酯^[5]。也有一些用于糖原形成。结果表明，这些微生物细胞内储备产品三种不同的类型：聚磷酸盐、糖原、聚羟基脂肪酸酯。

聚羟基脂肪酸酯是唯一在许多应用中包括医学、药学（植入，覆盖药品），和包装的应用中使用的具有生物降解性和生物相容性的线性聚酯。这些热塑性聚合物是由不同的细菌细胞内积累的颗粒作为碳源和能源的情况下限制增长的存储材料^[6]。超过40种不同的羟基链烷酸（HA）已被检测含有PHA，但只有很少的聚对羟基苯加酸酯（PHB）可从细菌中得到。根据不同类型的微生物和底物，它们可以产生不同成分的聚合物^[7]。结果表明，包含一定量戊酸酯（HV）的PHB聚合物，命名为聚（beta;－羟基丁酸酯－ｃｏ－beta;－羟基戊酸酯），可以通过酶的辅被作用物吸入而形成^[8]。

菌株如真养产碱杆菌和食油假单胞菌是有高产量的生物聚合物。带有3-羟基丁酸（HB）PHB均聚物和共聚物通过“Biopol”贸易的名义下的Zeneca目前成为工业生产的主要领域^[9]。A.基因突变株和葡萄糖和丙酸作为底物。共聚物具有更好的力学性能，使其适合于取代大块塑料。共聚物的物理性能的改进已经通过控制HV/HB摩尔比来进行。HV重复的链中存在硬度，结晶度和熔点降低的聚合物，从而提高其冲击强度和加工性能^[10]。聚合物的碳链长度决定的范围内的单体单元纳入PHA。3-羟基酸是由具有相同的碳链长度的基本单元形成的。6、8分子链的范围可以从600–35000个重复单元。

从这一点来看，在生物除磷工艺中合成的PHA是一种副产品。在目前的工作中，从活性污泥生物除磷中积累的PHA是聚（beta;－羟基丁酸酯－ｃｏ－beta;－羟基戊酸酯），均聚物的研究取得更多关注，但杂聚物似乎更值得研究^[11]。主要对聚合物在生物除磷过程中使用不同的碳源的厌氧阶段进行了研究。乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐分别作为单底物或混合增加整体的浓度，对进行厌氧阶段所形成的聚合物，确定其组成，平均分子量（MW），和多分散性（MW/Mn，Mn是数均分子量）^[12]。

材料与方法

生长条件

介质

另有说明，所使用的介质有以下组成（g/L）：氯化铵:0.16;硫酸镁:0.6；二水合氯化钙:0.07；EDTA：0.1；磷酸氢二钾：0.0923；磷酸二氢钾：0.0449；CH3COONa·3H2O：0.6799；丙酸：0.2115；丁酸：0.1761；矿物溶液：2ml（FeCl3·6H2O：1.5；硼酸：0.15；CuSO4·5H2O：0.03；碘化钾：0.03；Mn·4H2O：0.12；Na2MoO4 2H2O：0.06；ZnSO4·7H2O：0.12；CoCl2·6H2O：0.15）。灭菌前,pH通过加入5mg/L的NaOH调为7.2^[13]。

接种反应

从污水处理厂取活性污泥接种到一个SBR反应器中（里斯本）。在温度和PH值（25℃和7℃）控制下操作1.5个操作量的2个反应器，搅拌（250转/min）。污泥每天更换三次，连续循环。每个循环包括8小时：厌氧（2小时）、好氧（4小时）、沉淀（1小时）。沉淀后，三分之一上清液被替换为新鲜培养基（1小时）^[14]。气体喷射率为0.2时使用氩气进行厌氧阶段和用空气中的氧进行好氧阶段。取污泥滞留时间为10天通过每天在好氧阶段结束后清除污泥。

间歇反应器

活性污泥的定义是的从接种反应器，离心，重悬浮过程中除去新鲜培养基中含有的三分之一培养基上的磷酸盐浓度并用于接种反应。乙酸，丙酸，丁酸被加到可变浓度（在化学需氧量的化学需氧量）和用作碳源^[15]。除非另有说明，厌氧条件下提供了使用氩气作为喷射气体在0.2VVM。温度，PH值和搅拌速度是在接种中保持一定。

分析方法

细胞干重测定

细胞干重的测定按标准方法培养技术使用挥发性悬浮固体（VSS），培养液（5毫升）是通过Whatman GF/C玻璃纤维过滤器过滤（0.45毫米）预先烘干并称重。滤液在100°C下干燥，至少24小时，直到恒重。最后，滤液550°C煅烧2小时。这最后的两个重量之间的差异表示为VSS。

碳基

有机酸的测定采用Shodex sh1011色谱柱进行高性能液体色谱法;柱内洗脱液硫酸高0.01M，洗脱速度为1毫升/min，操作温度为50°C。紫外检测器在210nm下（默克达姆施塔特，德国）进行。在注射前，样品进行过滤，使用0.2微米的膜。用高效液相色谱法得到的有机酸的浓度被转换为化学需氧量，使用的氧化化学计量为每个酸^[16]。

聚羟基脂肪酸酯的量化

聚羟基脂肪酸酯的测定是由braunegg等和科莫等人完成，由Satoh.稍微修改。培养液（2毫升）进行离心分离，得到的颗粒悬浮在1毫升酸性甲醇（20%硫酸）0.5mg/ml苯甲酸为内标。这种混合物，添加1毫升氯仿溶液和保存在100℃内3.5小时，冷却后，提取0.5毫升的上清液。所收集的氯仿相，为了保水性加入分子筛（0.3纳米）^[17]。该设备采用气相色谱仪（chrompack）和火焰离子化检测器，温度设置为220°C。氯仿相（1微升）注射于柱在25m乘0.25毫米的chrompack cpsil-5cb柱。氦气作为载气。在分析温度的程序是：1分钟内在40℃；30℃/min的增加直到50°C；程序开始后2分钟，烤箱温度增加8℃/min直到160°C；最后1分钟保持在在160°C（总时间=16.75分钟）。注入口遵循烘箱温度程序。

利用PHB/HV（70%／30%；默克）作出标准曲线。九种不同浓度的标准进行相同的程序，用于样品和注入的气相色谱。获得了HB浓度和相应的峰面积之间的正相关关系，并得到了相应的峰面积。

进行测试以确定是否酸性醇解反应时间会影响PHA的恢复。选定的聚合物的回收的最佳时间为3.5小时。

聚羟基脂肪酸酯的聚合物分子量的测定

为了提取聚合物，取2ml培养液冻干。样品强力搅拌20小时并通过0.2微米的玻璃纤维过滤器，过滤后，跟氯仿提取相同的体积，样品在惰性气流中通过干燥，在真空干燥器干燥至恒重。得到的聚合物溶于氯仿，最终浓度为0.2%（W/V）。在注射前，使用一个0.2微米的膜过滤器过滤。

聚合物的特征，平均分子量使用凝胶渗透色谱/尺寸排除色谱法测定，包括一个由510型泵的溶剂输送系统，一个u6k注射器，和一个模式401折射率检测器。操作温度为30℃，使用氯仿作为洗脱剂。一系列的三个水域ultrastyragel柱，使用103Aring;，104Aring;和106Aring;。进行通用的校准和校准曲线的单分散聚苯乙烯（聚苯乙烯）标准（范围为3times;103至2times;104）而产生的。校准曲线是用Mark-Houwink关系[eta;]=Ktimes;Ma转化，其中[eta;]是粘度值的极限，K和a是Mark-Houwink常数，这些常数用于对PHB/氯仿和PS/氯仿各系统聚合物/溶剂/温度值分别为K=0.0118ml/g；a=0.78和K=0.0049ml/g；a=0.78。使用150毫升的样品注入量。

在所有的实验中，由于最显着的变化，预计将发生的碳源被消耗时，所以在所有的实验的初始阶段进行的大部分的分子量测定。

结果与讨论

碳源效应

聚羟基脂肪酸酯在生物除磷工艺的厌氧阶段生成。由于聚磷菌在有氧的条件下生长，可以认为，在实验过程中细胞浓度基本保持不变（在2.5–3g/L）。为了评价不同碳源对磷的释放和PHA生成的影响，从接种反应一部分污泥经上述处理并提交在厌氧过程中40小时，三种不同的碳基板（乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐）。同时设置一个没有碳源的添加使用的对照实验。

乙酸盐的吸收导致最佳的PHA生成而丁酸盐有助于低聚合物的形成（图3）。聚合物的生成也受碳源使用的影响（表1）。事实上，乙酸盐的消耗导致的HB聚合物与HV聚合物的生成，HB的生成量占主导地位（75.25%）。而使用丙酸盐，相反的行为发生，即，HV的生成量占主导地位（71.95%）。与其他2个基板相比，碳源为丁酸盐中的生成的聚合物的总量较少，同时HB略高于HV。在对照实验中，没有观察到净生成的HB或HV。科莫等人约生成HB相同值时使用乙酸乙酯（77%）和丁酸盐（52%）作为碳源，而使用丙酸时，得到的值要低得多（1%）。松尾等人观察，当乙酸盐作为碳源，87%的PHA生成HB，11%的PHA生成HV，而剩下的是2%的3-羟基-2-甲基丁酸（3h2mb）和1%的3-羟基-2-甲基戊酸（3h2mv）。以丙酸盐为碳源获得3%HB和剩余部分，包括HV（43%），3h2mv（50%）和3h2mb（6%）。

图4显示了3种底物的碳浓度的演化过程。所有的基板是完全消耗尽管是不同比率。观察到较高的底物

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