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羧甲基甲壳素的制备及热和pH敏感性研究

摘要：天然甲壳素的均相改性给直接结构控制提供了好处。在这项工作中，大范围高取代度、高乙酰化、几乎没发生解聚的新型羧甲基甲壳素在NaOH/尿素溶液中均匀地合成。第一次在酸性，氘化的水溶液的核磁共振氢谱中实现了从C3到C6的羧甲基甲壳素乙酰化，取代度和羧甲基化的同步测定。由于良好的均匀性，所制备的低取代度的CMCH-4，第一次就我们所知表现出热敏性和ph敏感性的双重性能。在生理条件的体温下，无毒的热敏聚合体系凝胶可有效的运用于药物运输和组织工程学的可注射性水凝胶。

关键词：均相合成，核磁共振质谱，羧甲基甲壳素，热反应性，ph反应性，可注射水凝胶。

1.前言

可溶性羧甲基甲壳素是甲壳素在生物医药领域中应用中最有吸引力的衍生物之一，这是由于甲壳素在各种普通溶剂中的溶解度很差，壳聚糖在水和其他有机溶剂中的溶解度很有限。据报道羧甲基甲壳素能减少血液成分的吸附，促进软骨形成，诱导骨形成，具有持久抗菌能力。此外，羧甲基甲壳素在体内可降解且不形成有毒的降解产物。到目前为止，羧甲基甲壳素被用于抗肥胖，药物运输，伤口敷料和组织工程。然而羧甲基甲壳素合成与表征的新方法相当有限，可能是由于晶体结构特征的强大互动和氢分子之间的甲壳素分子链结合。传统的羧甲基甲壳素合成方法涉及甲壳素浆料在浓氢氧化钠和异丙醇作用下在温度不断升高时进行异构反应。异构化的羧甲基甲壳素有一些缺点：由于反应条件苛刻聚合物降解、由于浓氢氧化钠和选择性替代的困难增加脱乙酰度、对羧甲基甲壳素的成分分布控制不佳。因此，异构化反应通常导致羧甲基甲壳素有限的功能作用从而限制了他的应用。

为了使甲壳素的羧甲基化以受控的方式进行，温和条件下在均相溶液中反应是可取的。最近，碱/尿素溶液体系被研究作为一种绿色甲壳素溶剂，由此一系列以甲壳素为基础的生物相容性材料已被直接构造。然而，在这种绿色溶剂系统中甲壳素的衍生化很少地被报道。此外，乙酰化程度和羧甲基化程度的精确测定以及羧甲基甲壳素的分布分数是很有挑战性的，但又非常关键。有几种技术已被开发来确定这几种量，包括红外和核磁共振谱、滴定法、元素分析法、差示扫描量热仪。目前为止没有一种独特的技术可以在大范围内高精度测量乙酰度。也没有已被报到的方法能提供完整精确的乙酰度，取代度以及羧甲基甲壳素中羧甲基分布分数数据。因此，探索一种可用于水溶性和非水溶性的高精度羧甲基甲壳素的方法是非常可取的。

在这项工作中，构建生物医学应用的生物相容性的智能水凝胶，一系列新的精细结构控制与环境（热反应聚糖和/或pH敏感性质）在“绿色溶剂”均匀合成（NaOH/尿素水溶液）基于活性天然甲壳素为方案1中所示。一个描述的详细结构信息的新方法（DA，DS和分布羧甲基组分数）这些聚糖轻便和核磁共振氢谱精确报道。探讨了双温度和pH敏感特性和产生的羧甲基壳聚糖的细胞毒性。

2.方法与原料

2.1原料

甲壳素粉是从金壳生化有限公司（浙江，中国）购买的。粘均分子量（M）为7.56times;105大根据Mark Houwink方程–报道（Li et al.，2010）。氯化氘（DCL，99.5% d；20% w/w）购自CIL（剑桥同位素实验室，MA，USA）。DCL（99% d；酸度37.5%）是由北京博雅大北科技开发采购（中国），TSP（2,2,3,3-d4-3 -（三甲基硅基）丙酸钠，98% d）从Alfa Aesar购买（MA，USA）。所有其他化学试剂均为分析纯，无需进一步纯化。

2.2羧甲基甲壳素的均相合成

羧甲基甲壳素（CMCH）是由一锅法均匀合成。甲壳素在11 wt%NaOH／4wt%的尿素水溶液中溶解，根据报道（Chang et al.，2011）。不同取代度（DS）羧甲基壳聚糖标本，命名为cmch-1–cmch-9（表1）。以cmch-1为例，2.3克一氯醋酸钠加入4重量%的甲壳素溶液（100克）在2℃下机械搅拌，反应系统保持在15℃ 持续24小时 整个反应过程中反应系统是透明的。在冰浴中用盐酸中和反应混合物，在蒸馏水中透析一周后冻干。

2.3异构合成羧甲基壳聚糖

作为对比，羧甲基壳聚糖还通过传统的非均相反应的略有修改的报道制备。40毫升40wt%NaOH溶液中加5g甲壳素，在minus;20℃下过夜. 将200 ml异丙醇加入解冻的甲壳素浆料。在35℃下加入28.8克氯乙酸钠与反应体系搅拌6小时后用盐酸中和。将混合物过滤，收集固体，用80%（体积分数）的醇/水和真空干燥洗涤。

2.4一般特性

用蒸馏水对在室温下过夜的聚合物浓度为10mg/ml的羧甲基壳聚糖的水溶性进行评价。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）在室温下被记录在波数范围400到4000厘米minus;1的FTIR光谱仪中（珀金埃尔默谱FTIR光谱仪），羧甲基壳聚糖进行酸化的报道：0.1克羧甲基壳聚糖悬浮在20毫升的80%体积分数的乙醇水溶液重，加入1ml盐酸（37wt%）搅拌30分钟，过滤出酸化的羧甲基甲壳素，用体积分数为70-90的冲洗至中性，真空干燥。

广角X射线衍射（X射线衍射）的测量在XRD衍射仪上进行（D8 ADVANCE，布鲁克，美国）。在40 kV和30mA下，Cu-K（波长= 0.154 nm）的辐射模式被记录在360°区域（从4°到40°），扫描速率为2min^-1。测试前将样品切成粉末，真空干燥48小时。

3结果与讨论

3.1羧甲基甲壳素的均相合成

羧甲基壳聚糖均相合成（CMCH）提供更好的控制优势得到更加均匀的化学成分。在目前的工作中，我们发现，控制结构可以容易地制备出均匀作用在氢氧化钠/尿素溶液通过醚化反应在氯乙酸钠的存在如图1所示。首先，反应中不使用任何有机溶剂搅拌要均匀，整个反应过程中保持完全透明，它不同于羧甲基甲壳素在异丙醇存在传统异构合成。

第二，羧甲基壳聚糖的合成进行了均匀在相对温和的条件下，羧甲基壳聚糖进行羧甲基壳聚糖的均匀合成导致更高的收益率（81-92%，表1）且几乎不脱-N-乙酰（N-乙酰化程度，大ge;0.82），也发生了传统非均相反应没有的异构化。对于异构反应，森多士等人研究了反应参数对如羧甲基甲壳素浓度（35–70%）和乙酰化程度（0.30–0.55）羧甲基壳聚糖生产产量的影响。他们的结论是，制备羧甲基甲壳素的最佳反应条件为60%的NaOH溶液浓度和反应温度35–40℃。作者认为，异质性的羧甲基化反应在较低的温度低于35℃是不可能的。众所周知，脱-N-乙酰和聚合将最有可能在这些严苛的条件下发生的。我们在均相反应的情况下，用11wt%的NaOH和15℃的温度获得了乙酰化程度为0.85的羧甲基甲壳素，产量超过80%。

由于乙酰氨基基团在碱性介质中可以水解程氨基酸组，我们可以很容易的在均相反应体系调整羧甲基甲壳素的乙酰化程度，通过改变反应温度、反应时间、反应物浓度。例如，在30℃反应45小时后可以得到乙酰化程度为0.55的羧甲基甲壳素.此外，反应温度为例，确定为87.3times;104 DA SEC-MALS是重均分子量Mw的cmch-9（图S1），而均分子量M的由来甲壳素75.6times;104。如上面实验部分说明，表明我们的均相反应条件在氢氧化钠/尿素溶液不会对甲壳素骨干的完整性明显的影响。不脱-N-乙酰羧甲基壳聚糖显示更低的毒性，有利于骨组织。

所有这些都表明，在这项工作中合成的羧甲基壳聚糖羧甲基的取代更均匀地分布在甲壳素链，比已报导的传统的羧甲基壳聚糖制备方法更加均匀。由于良好的均匀性，制备除出了均匀的羧甲基壳聚糖，第一次据我们所知，具有双热、pH敏感特性（见稍后讨论）。

3.2羧甲基甲壳素的表征

首先定性表征了羧甲基壳聚糖的结构（图1）。羧甲基壳聚糖进行酸化，如之前报道的FTIR测量。与原甲壳素红外光谱比较（图1A），两cmch-5光谱（图1b）和cmch-9（图1c）显示在1736cm^-1新的吸收峰，这对应于羧基（潭，楚，佩恩，和马拉，2009）。该吸收峰的强度从cmch-5到cmch-9明显增加，说明在羧甲基壳聚糖羧甲基基团含量增加。此外，可以看出，在1662cm^-1和1625cm^-1（1minus;1minus;酰胺I的吸收峰）羧甲基壳聚糖样品几乎没有变化和NH2无吸收峰出现在羧甲基壳聚糖样品，表明没有明显的脱-N-乙酰发生。

质子核磁共振（核磁共振）是一种用于精确测定结构的有效方法，未知样品（单个质子）没有以前的校准，如果适当的溶剂中可以发现，溶剂的质子不干扰。然而，通过质子核磁共振作用的精确成分分析已相当有限，因为取代羧甲基质子共振（-O-CH2-COO-）羧甲基壳聚糖与骨架的质子部分重叠（h-2-a H-3 / 6）和溶剂（HOD）也会干扰信号。为了解决这个问题，不同的氘代盐酸（DCL）浓度的重水作为聚糖1H NMR实验获得的溶剂，如图2所示。可以从图2清晰地看到，溶剂信号（HOD）从4.8到7 ppm时，DCL浓度从0增加到20%，这并没有干扰任何碳水化合物的质子，可能是由于水和酸质子之间的快速交换。理论上，在每个2-乙酰氨基-2-脱氧-葡萄糖的 C-3和C-6位置羟基（GlcNAc）单元可以在碱性体系直接与一氯醋酸钠羧甲基化。基于对羧甲基衍生物的D-葡萄糖的1H NMR谱完全分配，仅从C-6信号取代羧甲基质子是图2中分别观察到的，而不是从C-3取代的羧甲基质子。再一个 20%使用DCL为溶剂，C-6共振取代的羧甲基质子转移前场从4到4.3 ppm的优势，随着糖环质子峰完全解决。为了进一步验证溶液的pH值对-O-CH₂-COO组化学位移的影响，模型化合物2 -甲氧基丙烯酸的各种DCL浓度的D2O在25℃的核磁共振氢谱中记录（图2）。亚甲基质子2 -甲氧基丙烯酸的共振出现在4.13 ppm的纯重水和转移低至4.24 ppm的20% DCL D2O。这与在DCL / D2O中羧甲基壳聚糖取代度羧甲基质子化学位移发生了很大的变化。因此，C-6取代的羧甲基化的程度（ds-6）和均匀的合成羧甲基壳聚糖大值（非水解）由核磁共振氢谱总结在表1中。

从研究羧甲基纤维素酸水解,测量的分布分数完全水解后的羧甲基替换报告取代单体的葡萄糖。最近,Einbu和Varum报道,乙酰化的原始值几丁质样品测定准确集中DCl 1 h NMR谱和有效转换的甲壳素N-acetyl-glucosamine(GlcNAc)浓酸。在目前的工作,获得学位,颈代替carboxymethylation(DS-3)值获得CMCH样品通过质子核磁共振光谱学,CMCH的水解进行适度集中在50℃水DCl(20%)约36 h。水解是方便的进度监控通过观察增加异头物质子的核磁共振信号强度在降低降解糖类,导致的乳沟在甲壳素糖苷键。这些信号被观察到在图3之间的光谱区5.01和5.56 ppm。新单手的信号在4.6 ppm CMCH-9在20% DCl 50摄氏度中水解36 h这可以在图3观察到中,这是分配给颈- 3取代羧甲基质子的退化糖类。

图5显示了C3和C6的羧甲基化总分式函数，从水解羧甲基壳聚糖样品的质子核磁共振数据确定。可以从这个图看出，DS-3和ds-6线性增加DS总量分别增加。有在异丙醇中存在几丁质的异构羧甲基化一些小的差异，其中6位有轻微的负曲率的增加，随着总羧甲基正曲率3的位置增加了羧甲基化。此外，该ds-6为约4.7倍，相应的DS-3在各种反应条件在这项工作中的应用，说明了OH-6相对反应性比为4.7和OH-3替代网站的选择性控制。所有这些表明，甲壳素的同质羧甲基化提供良好的重现性和可预测性的取代度，导致一个统一的替代作用。在OH-6活性大于OH-3。这一结果与羧甲基甲壳素协议报道相同。众所周知，甲壳素的C-6羟基的反应活性高于C-3羟基是因为位阻效应较小，这种选择性作用更为明显，在较低的温度，使反应温度维持在15左右℃。

所有均匀合成羧甲基壳聚糖样品取代度数据列于表1。可以看出，从非水解ds-6水解样品是从水解样品大值，虽然未水解样品B／A比值稍微偏离理论B／A值6甲壳素单位，表明一些错误发生，DS-3值只能得到从后来的水解方法。因此，DS-3的值可以近似计算从质子核磁共振分析的非水解羧甲基壳聚糖制备样品均匀溶液中利用OH-6 OH-3相对竞聚率，虽然质子信号从羧甲基在C-3羟基不在核磁共振氢谱的定义范围内。

3.3羧甲基甲壳素的热、酸碱反应

温度、pH敏感的可生物降解的聚合物作为智能材料的生物医学应用的吸引力很大。均匀制备羧甲基壳聚糖聚合物的pH/温度响应行为进行了DLS，紫外–VIS和流变实验研究。图6显示的透光率–pH曲线对水溶液中羧甲基壳聚糖在37℃.所有得到的羧甲基壳聚糖样品在目前的工作中可以溶解在低碱浓度为1摩尔每升NaOH溶液，虽然它原来的几丁质不溶。当作用在DS值的增加，羧甲基壳聚糖的溶解度增强为溶pH范围变宽（图6）。聚合物溶液的透光率随pH值的降低，和相变的观察，指示作用的pH敏感聚合物。从图6中可以看出，随羧甲基化的DS下降，对于cmch-1，cmch-4和cmch-5，在过渡点的PH值约为12.5，7.5和4.5 。然而，对于更高的DS（DS gt; 0.4）羧甲基壳聚糖样品，没有观察到pH响应行为。

令人惊讶的是，cmch-4发现显示温敏行为（图五，该管逆变试验fig.s6观察）。在加热过程中cmch-4溶液在pH值7.4和2wt%的聚合物浓度下在加热过程中，在0.5℃／min的速率也证实了温敏凝胶溶胶–过渡特征与凝胶点在28.9℃（图7，储能模量G交叉（omega;）和损耗模量G（omega;）作为明显的凝胶点的指标），热响应行为是依赖于溶液的pH值（图五）。然而，对于水溶性的羧甲基壳聚糖样品高取代度（DS gt; 0.4），没有观察到热响应行为。因此，据我们所知，这是准备好的cmch-4已被证明具有双温度和pH敏感性质的第一次。这种热敏感的溶胶-凝胶聚合物体系，作为注射水凝胶药物输送和组织工程在体温时是非常有用的。

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