论文总字数：19332字

摘 要

为了提高获得蛹虫草CY1909菌株最佳培养条件,主要以虫草素产量和成本为主要指标,考察不同氮源组合、不同前体物质、微量元素及生长因子等影响虫草素合成的影响因素,通过单相因子试验和反应面实测试验方法进行了设计,对该菌株采用了液态发酵培养基进行优化。由结果显示，CY1909菌种产虫草素的最优培养基配方为(g/L^-1)：酵母蛋白胨52.25g/L^-1，酵母粉8.43g/L^-1、硫酸亚铁0.06g/L^-1、腺嘌呤 甘氨酸为3 12g/L^-1。对后续优化工作提供了支持。

关键词：蛹虫草；虫草素；发酵；培养基优化

Optimization of medium for cordycepin productio by shallow fermentation of Cordyceps militaris

Abstract

In order to obtain the best culture conditions of Cordyceps militaris CY1909 strain,mainly use cordycepin yield and cost as indicators to investigate the effects of different nitrogen source combinations, different precursor substances, trace elements and growth factors on the synthesis of cordycepin the liquid fermentation medium for this strain was optimized through single factor test and response surface test design. The results showed that the optimal medium formula (g/L^-1) for cordycepin production by CY1909 strain: yeast peptone 52.25g/L^-1, yeast powder 8.43g/L^-1, ferrous sulfate 0.06g/L^-1 , Adenine Glycine is 3 12g/L^-1. Provided support for subsequent optimization work.

Key words:Cordycepin senensis;Cordycepin;The fermentation;Medium optimized page breaks

目 录

第一章 引 言 1

1.1 简介 1

1.2 国内外现状 1

第二章 实验内容 3

2.1 实验材料 3

2.1.1供试菌种 3

2.1.2试剂 3

2.1.3培养基 3

2.2仪器与设备 3

2.3实验方法 3

2.3.1菌种培养方法 3

2.4虫草的配方优化 4

2.4.1氮源确定 4

2.4.2碳源确定 5

2.4.3温度确定 5

2.4.4 PH确定 5

2.4.5前体物质 5

2.4.6前体物质复配组合对虫草发酵影响 6

2.4.7微量元素优化 6

2.4.8金属离子优化实验 7

2.5响应面优化 7

2.6虫草素检测方法 10

2.7虫草素中的成分测定 11

2.7.1生物测量法 11

2.7.2 DNS法测还原糖（3,5–二硝基水杨酸法） 11

2.7.3苯酚-硫酸法测多糖 11

2.7.4考马斯亮蓝测蛋白 12

第三章 结果与讨论 13

3.1结论 13

3.2应用前景 13

致 谢 14

参考文献 15

引 言

1.1 简介

虫草抗菌素本身还可以具有多种的人体生物学活性,如具有抗炎和肿瘤、抗菌、耐恶性病毒、自我免疫功能调控以及抗炎。本项目针对目前发酵产虫草素水平低、成本高、发酵周期长及生产规模难以扩大等问题，以先前复合诱变高产虫草素菌株为实验菌株，基于原料精细化分析和响应面设计分析对发酵培养基中氮源、前体物质、微量元素、生长因子等进行优化。同时根据蛹虫草发酵特性，设计新型高效生物反应器，并对发酵放大过程进行多尺度参数优化分析和发酵验证，建立蛹虫草液体发酵新工艺。虫草素是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素，具有抑菌、抗肿瘤、免疫调节和抗炎症等生物学活性，由一个3-脱氧的核糖和腺嘌呤通过糖苷化连接而成。虫草素有化学法和生物法两种合成方法，其中化学合成工艺主要是以腺苷为原料，通过将腺苷的3'-位羟基溴代，再用自由基还原去除3'-位的溴制备虫草素。化学合成虫草素的过程中副产物较多，分离纯化的难度较大，因此目前虫草素合成多以生物法来获取^[1]。

蛹产生虫草素也是一种利用分子生物学上的方法被用来研究制备出蛹虫草素的重要植物菌株。由于目前传统的固态生物发酵方法工艺制备主要手段是直接利用人工小分子实体技术进行发酵固态生物培育，发酵生物工艺制备具有高度规模化和制备体量多，耗时费力，单位平方米空间内的发酵产量相对较低的缺点。而另一种新型虫草生物化学品的合成提取方法是它是通过高热液态和低温浅层混合发酵，采用低温液态和一定深度浅层发酵两种技术提取培养出来的多种蛹成体虫草素和菌丝体，其中这些虫草菌丝体的繁殖生长迅速、生产生命周期短、虫草素的提取产量高、提取的制备工艺比较简单。此次虫草发酵生产技术中的主流原料是目前国内经过大规模技术研究和开发生产出的虫草素。

此次试验对蛹虫草CY1909菌株分别进行了深层次发酵,以其中虫草素的含量和和材料成本作为主要检测指标,通过对培养基中碳源、氮源等品种的多个数据进行了实验性的考量，再通过响应面分析等方法对于蛹虫草生产出虫草素的液态培养基原料和配方分别进行了进一步优化,以便于获得蛹CY1909菌株高产生有害虫草素的培养基和食品配方，为后续此课题的工作提供了进一步的支持，为大家提供了参考意义。

1.2 国内外现状

培养基组成是影响蛹虫草菌体生长的重要因素，是实现虫草素高效液态发酵生产的关键。蛹虫草作为发酵生物培养基的主要成分不仅品种繁多,各个培养成分之间的相互交叉联合作用也是错综复杂,所以针对发酵培养基成分进行结构优化和后期管理就越来越明显。在生物数学化和统计研究领域及其中的二十多种优化发酵方法已经逐渐发展开始被广泛应用涉及到对各种微生物细胞进行优化发酵以及培养基结构优化的统计工作中,其中特别是一种响应生物表面的方法及其优化的应用效果最为明显。

近几年，通过国内外学者的共同努力，筛选出高产虫草素、虫草多糖、腺苷等成分的培养基。国外自19世纪中叶就已经初步开始了临床进行眼科病人吸食虫草的细菌发酵机理研究。kim等研究人通过这种摇动花瓶式的试验详细分析了这种蛹叶冬虫草与其他冬虫夏草两种草本植物的最好育种培养生长环境。Masuda研究添加腺苷和腺嘌呤等对虫草素发酵的影响，与对照组相比，虫草素浓度提高了15%^[2]。mao等人的研究表明,向培养基中添加40mol/L的铵离子，可以有效地促进虫草素的合成，推测其中含有一定数量的铵离子胁迫性物质能够引起次级代谢产物。shih等人通过对生产虫草素工艺的先进设计，确定了目前生产虫草素的最佳工艺条件即在ph浓度为6、酵母膏浓度为45g/L，振荡培养8天、静培育16天的条件下进行培养，虫草素的最佳产量分别为22mg/L、14.5mg/L,明显高于未优化前的静态培养发酵水平。das等研究人分别利用了以突变噬菌体g81-3为中心发酵体的菌株,采用作为中心碳源复合酵母设计的温度响应率和表面积方法进行定量分析,得到最佳碳源复合酵母糖中葡萄糖苷的浓度大约86.2g/L,氮源复合酵母蔗糖提取物的蔗糖浓度大约为93.8g/L，虫草素浓度为6.84g/L，发酵虫草素产量是对照的2.79倍^[3]。

剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：19332字