论文总字数：16119字

摘 要

南京正科医药股份有限公司生产的甲磺酸瑞波西汀片用于治疗成人抑郁症。本品为普通口服片剂，应进行微生物限度检查。依据《中国药典》2015年版四部 “1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”与“1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”，分别采用90mm培养皿倾注培养基法、0.45μm尼龙66滤膜过滤法、培养基稀释法、中和剂法进行微生物限度检查方法研究并对最终选定的方法进行验证。其验证方法为：其供试品制备方法为微生物计数法采用0.45μm尼龙66滤膜过滤法【10^-1每张膜的冲洗量为200毫升、10^-2采用常规-90mm培养皿倾注培养基法】；控制菌检查法采用0.45μm尼龙66滤膜过滤法【10毫升供试液分两张膜过滤，每张膜的冲洗量为200毫升】。

关键词:需氧菌总数；霉菌和酵母菌总数；0.45μm尼龙66滤膜过滤法

Mesylate, ripple paxil piece of research and verification method of microbial limit examination

Abstract

Nanjing is a pharmaceutical Co., Ltd production of methanesulfonic acid reboxetine tablets for the treatment of adults with depression, approved symbol country medicine accurate H20080557 specifications (4 mg. This product is a common oral tablet, should be microbial limit test. According to the 2015 edition of "Chinese Pharmacopoeia" four "1105 non sterile products of microbial limit test: microbiological counting method" and "1106 non sterile products of microbial limit examination: the control bacteria test method", respectively, using flat plate method, membrane filtration method, training medium dilution method, neutralizer method of microbial limit test method to study and validate the final selection of the method. The verification method: for the sample preparation method for counting of microorganisms by membrane filtration method [10-1 each film irrigation for 200mL, 10-2 using conventional flat plate method; control bacteria examination method by membrane filtration method [10mL probational liquid two membrane filtration, each film irrigation is 200mL].

Keywords: Total number of aerobic bacteria; mold and yeast count; membrane filtration

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 引 言 1

第二章 实验材料 2

2.1 仪器及耗材 2

2.2 培养基及试剂^[2] 2

2.3 菌种、菌液制备及稀释 2

第三章 预实验方法与结果分析 4

3.1 微生物计数法^{[2] [3]} 4

3.1.1 菌液稀释及供试液制备 4

3.1.2 90mm培养皿倾注培养基法 4

3.1.3 培养基稀释法^{[6] [7]} 6

3.1.4 中和剂法 7

3.1.5 0.45μm尼龙66滤膜过滤法 8

3.2 控制菌检查法 10

3.2.1 菌液稀释、计数及供试品制备 10

3.2.2 常规法 10

3.2.3 培养基稀释法 10

3.2.4 中和剂法 11

3.2.5 0.45μm尼龙66滤膜过滤法^[11] 12

第四章 非无菌产品微生物验证 14

4.1 微生物计数方法验证 14

4.2 控制菌检查方法验证 16

第五章 结论 17

致 谢 18

第一章 引 言

甲磺酸瑞波西汀片是治疗抑郁症的药物，抑郁症是一种精神疾病最为常见。在我国伴随着生活压力的加剧, 抑郁症患者正在不断增加，同时抑郁症的确诊和治疗也逐渐被很多的社区和初级医疗机构的医生所重视,并普遍为广大患者所接受。各种因素将给抑郁症带来很大的发展前景。

本文依据2015年版《中国药典》四部 “1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”与“1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”，采用多种方法进行了甲磺酸瑞波西汀片微生物限度的检查，最终确定微生物计数法为0.45μm尼龙66滤膜过滤法【10-1每张膜的冲洗量为200毫升、10-2采用常规-90mm培养皿倾注培养基法】；控制菌检查法采用0.45μm尼龙66滤膜过滤法【10毫升供试液分两张膜过滤，每张膜的冲洗量为200毫升】, 具有准确性和重现性，采用该方法进行甲磺酸瑞波西汀片微生物限度检查【微生物计数法；控制菌检查法】能始终如一地获得符合客观实际的数据和结果，真实的反映甲磺酸瑞波西汀片的微生物存在状况^[1]。

第二章 实验材料

2.1 仪器及耗材

天平（常州市双杰测试仪器厂 编号JJ1000）、高压蒸汽灭菌锅（威高集团 型号：MSLN）、恒温培养箱（上海博讯 型号：SPX-250BZ）、恒温培养箱（江苏科学器材公司 型号LRH-250A）、数显恒温水浴锅（国华电器公司 型号HH-4）、冰箱（澳柯玛 编号7ⅡB03402）、生物安全柜(型号 HR60-IIA2海尔有限公司)、手提式压力蒸汽灭菌锅（型号JR120609 上海申安医疗器械厂）、集菌仪（型号HTY-601 泰林科技）。

2.2 培养基及试剂^[2]

表2.1 培养基及试剂

2.3 菌种、菌液制备及稀释

1. 金葡CMCC（B）26003：

用接种环取金葡的胰酪大豆胨琼脂斜面培养物一环，接种至已灭菌的10毫升TSB培养基试管内，置恒温培养箱培养。

2. 枯草CMCC（B）63501：

用接种环取枯草的胰酪大豆胨琼脂斜面培养物一环，接种至已灭菌的10毫升TSB培养基试管内，置恒温培养箱培养。

3. 铜绿CMCC（B）10104：

取枯草的胰酪大豆胨琼脂斜面培养物，用4～5毫升的pH7.0将芽孢洗脱，转移至已灭菌的试管备用。

4. 白念CMCC（F）98001：

取白念的沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物一环，接种至已灭菌的10毫升SDB培养基试管内，置恒温培养箱培养。

5. 黑曲霉CMCC（F）98003：

取用SDA培养基在20～25℃恒温培养箱培养5～7天的黑曲霉的新鲜培养物，加入含0.05%吐温80的 pH7.0 4～5毫升，将孢子洗脱，然后用移液器吸出孢子悬液至已灭菌试管内备用。

6. 大肠CMCC（B）44102：

枯草的胰酪大豆胨琼脂斜面培养物，用4～5毫升，pH7.0将芽孢洗脱，转移至已灭菌的试管备用。

第三章 预实验方法与结果分析

3.1 微生物计数法^{[2] [3]}

3.1.1 菌液稀释及供试液制备

取上述制备的新鲜培养物金葡菌液1毫升，用移液器转移至已灭菌的试管内，加入9毫升无菌 pH7.0，依次10倍系列稀释至适宜浓度（取0.1毫升加入9.9毫升 pH7.0，摇匀，制备的菌悬液含菌量小于100cfu/毫升）备用，铜绿、枯草、白念菌悬液的制备同金葡；取上述制备的1毫升黑曲霉菌悬液，加入含0.05%吐温80的 pH7.0中，10倍系列稀释至相应浓度的菌悬液（取0.1毫升加入9.9毫升 含0.05%（cfu/毫升）聚山梨酯80的 pH7.0，摇匀，制备的菌悬液含菌量小于100cfu/毫升）备用。

供试液制备：取甲磺酸瑞波西汀片10g，放入装有100毫升 pH7.0的无菌瓶中，用手摇动混匀，即得1：10供试液①。用移液器吸1：10均匀供试液10毫升，加入装有90毫升 pH7.0的试管中，混匀，即得1：100供试液②。

表3.1 活菌计数稀释级（含菌不大于100cfu/毫升）

3.1.2 90mm培养皿倾注培养基法

1. 试验组：

取上述供试液①和②各9.9毫升，加入0.1毫升金葡菌液，混匀（制备的供试液含菌量不大于100cfu/毫升），取1毫升注入直径为90mm的两块无菌培养皿中，倒入一定量的已灭菌的TSA培养基，用手摇匀，待培养基冷却，把培养皿倒放，放置培养箱培养。

同法操作制备枯草、铜绿、白念、黑曲霉平板。将上述制备的培养皿置培养箱培养，温度设置为30到35摄氏度。接种金葡、枯草、铜绿的培养基培养不超过3天，接种白念、黑曲霉的培养基培养不超过5天。观察菌落，点记生长菌数。

同法制备白念与黑曲霉的沙氏葡萄糖琼脂平板，置20~25℃培养不超过五天。

1. 供试品对照组：

取上述供试液①和②各1毫升，注入直径为90mm的无菌培养皿中，倒入一定量的已灭菌的TSA培养基和SDA培养基，用手摇匀，待培养基冷却，把培养皿倒放，放置培养箱培养。将上述制备的平板置20~25℃和30到35摄氏度恒温培养箱中培养培养不超过5天^[4]，观察菌落，点记生长菌数。

1. 菌液对照组：

取 pH7.0 9.9毫升，加入0.1毫升金葡菌液，混匀（制备的菌悬液含菌量不大于100cfu/毫升），取1毫升注入直径为90mm的无菌培养皿中，倒入一定量的已灭菌的TSA培养基，用手摇匀，待培养基冷却，把培养皿倒放，放置培养箱培养。

同法操作制备枯草、铜绿、白念、黑曲霉平板，每株菌平行制备两块平皿。将上述制备的培养皿置培养箱培养，温度设置为30到35摄氏度。接种金葡、枯草、铜绿的培养基培养不超过3天，接种白念、黑曲霉的培养基培养不超过5天。观察菌落，点记生长菌数^[5]。

同法制备白念与黑曲霉的沙氏葡萄糖琼脂平板，置20~25℃培养不超过五天。

结果见表3.2、表3.3，试验组回收率为试验组菌落数与供试品对照组相减然后与菌液对照组的比值。

表3.2 90mm培养皿倾注培养基法1:10供试液各组菌落数及回收率

表3.3 90mm培养皿倾注培养基法1:100供试液各组菌落数及回收率

结论：由表3.2可知，五株菌在TSA和SDA培养基中的回收率均不在0.5-2范围内，回收率不合格；由表3.3可知，金葡、铜绿、枯草、白念、黑曲霉在TSA培养基上的菌数回收率分别为0.96、0.95、1.05、0.95、0.91；白念和黑曲霉在SDA培养基中的菌数回收率分别为0.96、0.90，均在0.5-2范围内。

故甲磺酸瑞波西汀片1:100的供试液计数方法可采用90mm培养皿倾注培养基法进行验证；而1:10的供试液对五株菌均有抑制作用，说明甲磺酸瑞波西汀片存在抑菌作用，应改变1:10供试液的制备方法，消除供试品的抑菌活性。

3.1.3 培养基稀释法^{[6] [7]}

1. 试验组：

取上述供试液①9.9毫升，加入0.1毫升金葡菌液，混匀（制备的供试液含菌量不大于100cfu/毫升），取1毫升平均注入直径为150mm的一块或两块无菌培养皿中，倒入80毫升已灭菌的TSA培养基，用手摇匀，待培养基冷却，把培养皿倒放，放置培养箱培养。

同法操作制备枯草、铜绿、白念、黑曲霉平板。将上述制备的培养皿置培养箱培养，温度设置为30到35摄氏度。接种金葡、枯草、铜绿的培养基培养不超过3天，接种白念、黑曲霉的培养基培养不超过5天。观察菌落，点记生长菌数。

同法制备白念与黑曲霉的沙氏葡萄糖琼脂平板，置20~25℃培养不超过五天。

1. 供试品对照组：

取上述供试液①1毫升，取1毫升平均注入直径为150mm的一块或两块无菌培养皿中，倒入80毫升已灭菌的TSA培养基和SDA培养基，用手摇匀，待培养基冷却，把培养皿倒放，放置培养箱培养。将上述制备的平板置20~25℃和30到35摄氏度恒温培养箱中培养培养不超过5天。观察菌落，点记生长菌数。

1. 菌液对照组：

取pH7.0 9.9毫升，加入0.1毫升金葡菌液，混匀（制备的菌悬液含菌量不大于100cfu/毫升），取1毫升平均注入直径为90mm的两块无菌培养皿中，倒入一定量的已灭菌的TSA培养基，用手摇匀，待培养基冷却，把培养皿倒放，放置培养箱培养。

同法操作制备枯草、铜绿、白念、黑曲霉平板，每株菌平行制备两块平皿。将上述制备的培养皿置培养箱培养，温度设置为30到35摄氏度。接种金葡、枯草、铜绿的培养基培养不超过3天，接种白念、黑曲霉的培养基培养不超过5天。观察菌落，点记生长菌数。

同法制备白念与黑曲霉的沙氏葡萄糖琼脂平板，置20~25℃培养不超过五天。

结果见表3.4，试验组回收率为试验组菌落数与供试品对照组相减然后与菌液对照组的比值。

表3.4 培养基稀释法各组菌落数及回收率

.

结论：由表3.4可知，五株菌在TSA和SDA培养基中的回收率均不在0.5-2范围内，回收率不合格，且150mm平板一块和两块对提高菌种的回收率作用不大，所用通过增加培养基体积提高菌种回收率的方法不可行，需进一步摸索实验方法。

3.1.4 中和剂法

1. 试验组：

取上述供试液①9.9毫升，加入0.1毫升金葡菌液，混匀（制备的供试液含菌量不大于100cfu/毫升），取1毫升注入直径为90mm的两块无菌培养皿中，倒入一定量的已灭菌的含0.1mol/L MgSO₄的TSA培养基，用手摇匀，待培养基冷却，把培养皿倒放，放置培养箱培养。

同法操作制备枯草、铜绿、白念、黑曲霉平板。将上述制备的培养皿置培养箱培养，温度设置为30到35摄氏度。接种金葡、枯草、铜绿的培养基培养不超过3天，接种白念、黑曲霉的培养基培养不超过5天^[8]。观察菌落，点记生长菌数。

同法制备白念与黑曲霉的沙氏葡萄糖琼脂平板，置20~25℃培养不超过五天。

1. 供试品对照组：

取上述供试液①1毫升注入直径为90mm的两块无菌培养皿中，倒入一定量的已灭菌的TSA培养基和SDA培养基，用手摇匀，待培养基冷却，把培养皿倒放，放置培养箱培养。将上述制备的平板置20~25℃和30到35摄氏度恒温培养箱中培养培养不超过5天。观察菌落，点记生长菌数。

1. 菌液对照组：

取 pH7.0 9.9毫升，加入0.1毫升金葡菌液，混匀（制备的菌悬液含菌量不大于100cfu/毫升），取1毫升平均注入直径为90mm的两块无菌培养皿中，倒入一定量的已灭菌的TSA培养基，用手摇匀，待培养基冷却，把培养皿倒放，放置培养箱培养。

同法操作制备枯草、铜绿、白念、黑曲霉平板，每株菌平行制备两块平皿。将上述制备的培养皿置培养箱培养，温度设置为30到35摄氏度。^[10]接种金葡、枯草、铜绿的培养基培养不超过3天，接种白念、黑曲霉的培养基培养不超过5天。观察菌落，点记生长菌数。

同法制备白念与黑曲霉的沙氏葡萄糖琼脂平板，置20~25℃培养不超过五天。

结果见表3.5，试验组回收率为试验组菌落数与供试品对照组相减然后与菌液对照组的比值。

表3.5 中和剂法供试液各组菌落数及回收率

.

结论：由表3.5可知，五株菌在TSA和SDA培养基中的回收率均不在0.5-2范围内，回收率不合格，加入中和剂对提高菌种的回收率不起作用，所以中和剂法不能作为甲磺酸瑞波西汀片微生物限度检查的方法。

3.1.5 0.45μm尼龙66滤膜过滤法

1. 试验组：

取上述供试液①1毫升，注入装有100毫升 pH7.0的薄膜过滤器中混匀，用集菌仪【泵速小于160r/min】使其全部通过滤膜【滤膜，材质-尼龙，直径50mm，孔径0.45μm】，以 pH 7.0为冲洗液，再冲洗1次，每次冲洗量为100毫升。在最后一次冲洗液中加入1毫升不大于100cfu的金葡，冲洗结束后，取出滤膜，菌面朝上贴于直径为90mm的已凝固的含0.01mg/毫升的TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)TSA培养基平板上，倒置；将上述制备的培养皿置培养箱培养，温度设置为30到35摄氏度。接种金葡、枯草、铜绿的培养基培养不超过3天，接种白念、黑曲霉的培养基培养不超过5天。观察菌落，点记生长菌数。

同法制备白念与黑曲霉的沙氏葡萄糖琼脂平板，置20~25℃培养不超过五天。

1. 供试品对照组：

取上述供试液①1毫升，注入装有100毫升 pH7.0的薄膜过滤器中混匀，用集菌仪【泵速小于160r/min】使其全部通过滤膜【滤膜，材质-尼龙，直径50mm，孔径0.45μm】，以 pH7.0为冲洗液，再冲洗1次，每次冲洗量为100毫升。冲洗结束后，取出滤膜，菌面朝上贴于直径为90mm的已凝固的含0.01mg/毫升的TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)TSA培养基平板上，倒置，将上述制备的培养皿置培养箱培养，温度设置为30到35摄氏度。培养不超过5天。同法制备沙氏葡萄糖琼脂平板，置20~25℃培养不超过五天。观察菌落，点记生长菌数。

1. 菌液对照组：

取 pH7.0 的9.9毫升，加入0.1毫升金葡菌液，混匀（制备的菌悬液含菌量不大于100cfu/毫升），取1毫升注入直径为90mm的无菌培养皿中，倒入一定量的已灭菌的TSA培养基，用手摇匀，待培养基冷却，把培养皿倒放，放置培养箱培养。同法操作制备枯草、铜绿、白念、黑曲霉平板，每株菌平行制备两块平皿。将上述制备的培养皿置培养箱培养，温度设置为30到35摄氏度。接种金葡、枯草、铜绿的培养基培养不超过3天，接种白念、黑曲霉的培养基培养不超过5天。

同法制备白念与黑曲霉的沙氏葡萄糖琼脂平板，置20~25℃培养不超过五天。观察菌落，点记生长菌数。

1. TTC对照组：

取 pH7.0 9.9毫升，加入0.1毫升金葡菌液（制备的菌悬液含菌量不大于100cfu/毫升），取1毫升注入装有100毫升 pH7.0 的薄膜过滤器中混匀，用集菌仪【泵速小于160r/min】使其全部通过滤膜【滤膜，材质-尼龙，直径50mm，孔径0.45μm】，冲洗结束后，取出滤膜，菌面朝上贴于直径为90mm的已凝固的含0.01mg/毫升的TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)TSA培养基平板上，倒置，将上述制备的培养皿置培养箱培养，温度设置为30到35摄氏度。接种金葡、枯草、铜绿的培养基培养不超过3天，接种白念、黑曲霉的培养基培养不超过5天。

同法制备白念与黑曲霉的沙氏葡萄糖琼脂平板，置20~25℃培养不超过五天。观察菌落，点记生长菌数。

表3.6 0.45μm尼龙66滤膜过滤法供试液各组菌落数及回收率

.

剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：16119字