摘 要

本研究是在羧甲基壳聚糖/胶原蛋白肽中分别添加不同比例的氧化魔芋作为交联剂，通过羧甲基壳聚糖/胶原蛋白肽与氧化魔芋发生希夫碱共轭反应交联，制备出羧甲基壳聚糖/胶原蛋白肽/氧化魔芋的新型水凝胶敷料。

研究结果表明不同比例的氧化魔芋对羧甲基壳聚糖/胶原蛋白肽/氧化魔芋水凝胶的性能有一定影响，氧化魔芋添加比例达到0.6时水凝胶微孔排列紧密，连续无间断，并且在凝胶时间、溶胀率、血液相容性方面表现优良。当氧化魔芋添加比例为0.6时，凝胶时间最短为7s，溶胀率最高可达581%，氧化魔芋添加比例对溶胀性能等也有一定影响。

壳聚糖衍生物不仅保留了壳聚糖本身的优良性能，还具有良好的水溶性，以及更好的生物活性和医用价值，可作为优良的生物医用材料。魔芋葡甘聚糖是从魔芋上提取的一种资源丰富，价格低廉，安全无毒，生物相容性和生物可降解性良好，且具有多种生理功能的天然多糖，本论文以氧化魔芋作为交联剂代替常用的不利于人体健康的乙二醛、戊二醛等有毒的化学交联剂，与羧甲基壳聚糖/胶原蛋白肽进行交联，从而得到一种具有医用潜力的新型水凝胶。

关键词：羧甲基壳聚糖；胶原蛋白肽；氧化魔芋；新型水凝胶；医用敷料

Abstract

In this study, carboxymethyl chitosan/collagen peptides (CMC-COP) were added in different proportions of oxidized konjac (OKGM) as a cross-linking agent. The hydrogel dressings of CMC-COP/OKGM were prepared by crosslinking with the conjugate reaction with CMC-COP and OKGM.

The results showed that different proportions of OKGM had certain effects on the properties of CMC-COP/OKGM hydrogel. When the proportion of OKGM reached 0.6, the micropores of hydrogel were closely arranged and continuous without interruption. Excellent gelation time, swelling rate, and blood compatibility. When the addition ratio of OKGM was 0.6, the gelling time was the shortest 7s. And the swelling rate was up to 581%. The addition ratio of OKGM also had a certain effect on the swelling performance.

Chitosan derivatives not only retain the excellent performance of chitosan itself, but also have good water solubility, as well as better biological activity and medical value, and can be used as excellent biomedical materials. Konjac glucomannan is a natural polysaccharide with abundant resources, low price, safety, non-toxicity, good biocompatibility and biodegradability, and a variety of physiological functions. In this paper, konjac glucomannan was used as a cross-linking agent instead of the commonly used one. Glyoxal, glutaraldehyde, and other toxic chemical cross-linkers that are unfavorable to human health are cross-linked with carboxymethyl chitosan/collagen peptides, resulting in a novel hydrogel with medical potential hydrogel.

Keywords: Carboxymethyl chitosan; Collagen peptide; Oxidative konjac; New hydrogel; Medical dressing

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1魔芋葡甘聚糖 1

1.1.1魔芋葡甘聚糖的概况 1

1.1.2魔芋葡甘聚糖的结构 1

1.1.3魔芋葡甘聚糖的性质 2

1.1.3.1水溶性和保水性 2

1.1.3.2增稠性 2

1.1.3.3成膜性 2

1.2羧甲基壳聚糖 3

1.2.1羧甲基壳聚糖的概述 3

1.2.2羧甲基壳聚糖的结构 3

1.2.2.1 N-CMC 3

1.2.2.2 O-CMC 3

1.2.2.3 N,O-CMC 4

1.2.3羧甲基壳聚糖的理化性质和生物学性质 4

1.3胶原蛋白肽概述 5

1.4 水凝胶概述 6

1.4.1水凝胶的定义 6

1.4.2 水凝胶的应用 6

1.4.2.1 生活日用品 6

1.4.2.2 生物医药 6

1.4.2.3 工业及其他方面 7

1.5本课题的研究内容与意义 7

第二章 羧甲基壳聚糖/胶原蛋白肽/氧化魔芋水凝胶的制备及性能研究 9

2.1引言 9

2.2 羧甲基壳聚糖/胶原蛋白肽/氧化魔芋复合水凝胶的制备和表征 10

2.2.1实验试剂及仪器 10

2.2.2羧甲基壳聚糖的制备 11

2.2.3 MTGase的纯化 11

2.2.4 CMC-COP的制备 11

2.2.5 氧化魔芋的制备 12

2.2.6 羧甲基壳聚糖/胶原蛋白肽/氧化魔芋水凝胶的制备 13

2.2.7 CMC-COP的表征 13

2.2.7.1 CMC-COP的红外表征 13

2.2.7.2 CMC-COP的¹H-NMR表征 13

2.2.8水凝胶的红外表征 14

2.2.9水凝胶的扫描电镜测试 14

2.2.10 氧化魔芋氧化度测试 14

2.3羧甲基壳聚糖/胶原蛋白肽/氧化魔芋水凝胶的性能研究 14

2.3.1水凝胶凝胶时间的测试 14

2.3.2水凝胶溶胀性能的测试 15

2.3.3水凝胶溶血试验 15

第三章 结果与讨论 16

3.1氧化度分析 16

3.2 CMC-COP的红外表征 16

3.3 CMC-COP的¹H-NMR表征 17

3.4 CMC-COP/OKGM水凝胶的红外图谱分析 18

3.5 水凝胶扫描电镜分析 19

3.6 凝胶时间 21

3.7 水凝胶溶胀性能 21

3.8溶血性能 22

3.9 本章小结 24

第四章 结论 25

参考文献 26

致谢 28

第一章 绪论

1.1魔芋葡甘聚糖

1.1.1魔芋葡甘聚糖的概况

魔芋学名蒟蒻，其英文名为Anorphophallus Konjac。魔芋是多年生草本块茎植物，属于天南星科。其产地主要分布在东南亚和非洲等热带或者亚热带地区。魔芋需要比较特殊的生长环境，由于魔芋的地下部分为球茎状且根系较长，因此需要在土层深厚、质地松软、良好的排水及透气、富含大量有机质的轻砂土壤中生长，肥沃的土壤是保证魔芋有良好收成的重要条件。魔芋拥有降低高血压、高血脂、高血糖、增强免疫力、促进排毒通便等保健效果，同时还拥有非常高的工业价值。魔芋葡甘聚糖是魔芋的主要成分，是一种拥有十分广阔的应用前景的可再生天然资源。它具有良好的胶凝性，成膜性，增稠性和保水性，具有一定的防癌抗癌效果，作为保健食品和食品添加剂有广泛应用^[1,2]。

1.1.2魔芋葡甘聚糖的结构

魔芋葡甘聚糖（KGM），其英文名为Konjac Gulcomannnan，是魔芋块茎部分的主要成分，属于水溶性的非离子型天然多糖，通过β-1,4吡喃糖苷键结合D-甘露糖和D-葡萄糖构成主链，同时在主链甘露糖的C-3位上存在有以β-1,3糖苷键组成的支链结构，甘露糖的C-6位上则存在有以酯键结合的乙酰基团。大约每32个糖残基上有3个支链，每19个糖残基上有一个乙酰基团^[3,4]。从魔芋块茎中提取出的KGM其结构是由放射状排列的胶束组成的，KGM的分子量则随着魔芋的生产地、魔芋品种、提取方法以及魔芋贮藏时间的不同而不同，其分子量一般在200-2000 kDa。KGM的结构形态有α型（非晶型）和β型（晶型）两种。魔芋葡甘聚糖因为分子上存在着丰富的羟基，所以具有很好的反应活性，同时方便进行多次改性以提高其应用性能^[5]。魔芋葡甘聚糖的化学结构示意图如下图1-1所示。

图1-1魔芋葡甘聚糖的化学结构

1.1.3魔芋葡甘聚糖的性质

1.1.3.1水溶性和保水性

由于大量的羟基，羰基等亲水性基团分布在魔芋葡甘聚糖的分子上，因此它可以易溶于水，难容或不溶于甲醇、乙醇、氯仿等有机溶剂。KGM还可以在氢键、分子偶极、诱导偶极等作用力的帮助下与水形成难以运动的巨大分子，这使得魔芋葡甘聚糖溶液在水中表现为非牛顿型流体。质量分数小于0.5%的魔芋精粉在水中可以形成稀溶液，质量分数大于1%的呈半胶冻或胶冻的溶胀状态，同时其保水量可以达到自身重量的40倍^[7]。

1.1.3.2增稠性

因为KGM的相对分子量较大并且不带有电荷，结合水的能力较好，水溶液的粘度高，1%质量分数的水溶液粘度便可达数十至数百帕斯卡·秒，所以具有很好的增稠作用。魔芋葡甘聚糖因为其自身不携带电荷，为非离子型多糖，与果胶、黄原胶、瓜尔豆胶等传统增稠剂相比，其增稠性受盐的影响比较小。同时，它还可以与海藻酸钠、淀粉等增稠剂产生协同作用进行增稠，使其粘度大幅度提升。

1.1.3.3成膜性

KGM因为在低温（10-15℃）下呈现糊状或者液态，常温却又呈现固态，冷却后又恢复液态这一不同于一般物质的特殊可逆性，使KGM具有很好的成膜性。KGM脱水后形成的薄膜具有很好的稳定性，能够适应冷热水以及不同酸碱度的溶液，是一种有高保水性的多糖膜。根据添加剂的不同膜的透水性会有所改变，亲水性的添加剂可以增加其透水性，相反，疏水性的添加剂则会降低其透水性^[8]。

1.2羧甲基壳聚糖

1.2.1羧甲基壳聚糖的概述

将壳聚糖（CS）进行改性，通过接枝上羧甲基基团的羧甲基壳聚糖（CMC）是壳聚糖众多的衍生物中较为常见的一种。CMC有着良好的生物相容性，较高的水溶性，以及可控的生物降解性等突出的特性。研究表明由于羧甲基的引入使得CMC在有着新的理化性质和生物特性的同时还保留有CS的优异性能。相比于其他的壳聚糖衍生物，羧甲基壳聚糖有着制作简单、水溶性较高、生物相容性好等特点，因此人们对其的研究与应用也比较充分。

1.2.2羧甲基壳聚糖的结构

由于反应条件的改变会导致不同程度和不同位置的取代，因此羧甲基壳聚糖有N-CMC、O-CMC、N,O-CMC三种类型。

1.2.2.1 N-CMC

N-CMC的合成是在微酸介质中进行的，羧甲基取代基完全置于N-原子上，没有O-原子取代^[9]。

1.2.2.2 O-CMC

O-CMC是拥有羧基基团和氨基基团的两性醚衍生物。合成O-CMC的反应介质一般是强碱性的^[10]。

1.2.2.3 N,O-CMC

N,O-CMC是CMC的一些氨基和伯羟基位置处带有羧甲基取代基的CS衍生物^[11]。

N,O-CMC

1.2.3羧甲基壳聚糖的理化性质和生物学性质

由于壳聚糖接枝羧甲基使得羧甲基壳聚糖在拥有着新的理化性质的同时还保留着壳聚糖的优异性能，因此羧甲基壳聚糖有一系列良好的理化性质和生物特性，比如良好的抗菌性、吸湿保湿性、水溶性、抗氧化性、抗肿瘤、促进细胞增殖等优异的性能，拥有着广阔的研究和应用前景。

由于亲水性的羧甲基基团引入破坏了壳聚糖晶体的规整性，降低了结晶度，使得羧甲基壳聚糖的溶解性发生了明显的改善。因此羧甲基壳聚糖展现了一定的水溶性^[12]。

由于羧甲基壳聚糖的结构中有着大量的活性基团如氨基、羟基和羧甲基等，这些基团可以和水形成氢键，进而增强了羧甲基壳聚糖的吸湿保湿性^[13]。

壳聚糖具有一定抗菌性，目前对其的抗菌机制研究较为广泛，并从不同方面提出了多种抗菌机制原理。其中一种机制指出，CS能够与DNA结合从而抑制RNA的生成；另一种机制认为CS的阳离子性质可以干扰细胞表面的大分子物质，改变细胞的渗透性。羧甲基壳聚糖具有与壳聚糖相似的抗微生物活性，研究表明羧甲基壳聚糖的抗菌活性不仅与取代度和分子量有关，还与羧甲基的取代位置、细胞种类和浓度有关。其抗菌活性按照N,O-CMClt;CSlt;O-CMC的顺序增加，这可能是因为抗菌作用主要依赖于氨基基团，由于N,O-CMC中的羧甲基取代导致氨基的有效数量减少，抗菌作用降低。而O-CMC中由于羧甲基只在羟基处进行取代，氨基的数量并没有减少，因此具有增强的抗菌活性^[14]。

羧甲基壳聚糖具有增强的抗氧化活性，且抗氧化活性主要取决于CMC中的活性羟基和氨基的含量。同时通过研究不同分子量的CMC可以发现低分子量的CMC对氧负离子有更好的清洁效果，这可能是因为随着分子量的降低CMC的抗氧化性由于分子与分子间的内部氢键松动而有所增加^[15]。

羧甲基壳聚糖具有一定的抗肿瘤功效。由于肿瘤细胞有着比正常细胞更多的负电荷，而CMC结构表面带有一定的正电荷，因此通过静电作用，CMC可以选择性的吸附在肿瘤细胞的表面上，从而起到抑制其细胞生长的作用。同时通过体外实验表明，CMC可以通过杀死肿瘤细胞和增强机体免疫力来达到抗肿瘤的作用，这对于将其作为生物医疗材料在肿瘤应用中是有效且安全的^[16]。

羧甲基壳聚糖还拥有促进细胞增殖、分化、粘附的特性。Rasad等分别评估了CMC在糊状和片状形式中的细胞毒性，结论表明CMC能在有效的促进皮肤层纤维细胞的增长的同时通过控制MMP-13的表达来抑制增长生性瘢痕细胞的活性，减少瘢痕的形成。因此羧甲基壳聚糖在创面修复、整形等方向上有一定的发展应用前景^[17]。

1.3胶原蛋白肽概述

胶原蛋白（也称胶原）是存在于人体组织（皮肤、韧带和肌腱等）的细胞外基质中含量最高的一种结构蛋白质，英文名“collagen”，属于多糖蛋白，固体粉末呈白色，分子式中有着少量的半乳糖和葡萄糖。胶原蛋白有很强的延展力，不溶解于水，能被酸分解，其化学结构为三螺旋状结构。

胶原蛋白有多达28种不同的基因，常见类型为Ⅰ型（肌腱、皮肤和骨骼）、Ⅱ型（软骨）和Ⅲ型（脉管系统），胶原蛋白拥有生物相容性高、可生物降解性以及细胞和组织粘附性等优异特点，因而在食品、医药、组织工程、化妆品等领域有着广泛的研究和应用前景。在已知的医学领域中，由于胶原蛋白有着低免疫原性、纤维的再形成性、强的机械性能、在体内易被人体吸收、能促进细胞的成活与生长、促进血小板凝结等优点，被广泛应用于胶原海绵、胶原膜、胶囊、固定化美酶载体和人工皮肤等领域。它不仅可以作为保健食品、美容产品、包装材料，还可以作为食品添加剂应用在肉制品改良、冷冻食品、饮料、糕点以及乳制品等中^[18]。

胶原蛋白肽（COP）是经蛋白酶或热的办法使得高分子胶原蛋白降解后得到的产物，其分子量大约在3000道尔顿左右。胶原蛋白肽除了具有普通多肽生物活性高、分子量小、无毒和易吸收等典型特征之外，还因其独特的结构特征，分子上脯氨酸、羟脯氨酸的含量大大高于其他的活性肽，故又有许多其他生物功能。已有的研究表明COP含有独特的“表皮生长因子”，不仅能够促进细胞的分裂，消除疤痕，抚平皮肤皱纹，延缓皮肤的衰老，与此同时，胶原蛋白还可以作为结缔组织的粘合物质，在皮肤中通过和弹性纤维一起构成一张能够锁住水分从而保持皮肤的水润光泽；在骨骼方面胶原蛋白肽能够在低钙水平下增强骨胶原结构以提高了骨强度，防止骨质疏松的出现，也可以促进骨骼的再生成；另外胶原蛋白肽还具有其它许多特殊的生理功能：如保护胃粘膜和抗溃疡作用，抗过敏作用等^[19]。

1.4 水凝胶概述

1.4.1水凝胶的定义

水凝胶是通过亲水性高分子材料进行物理或化学交联而形成的具有三维网络或互穿网络的聚合物，能够不溶解于水却可以吸水溶胀并保持大量水分。水凝胶的物质形态介于固体和液体之间，从宏观上看，水凝胶的粘弹性如同橡胶一样，在外力作用的情况下会发生变形，撤去外力后能在一段时间内恢复原来的形态；从微观上看，水溶胶因为其自身的三维网状结构使得亲水性的水溶小分子可以在其中自由扩散体现出了液体一般的性质。

1.4.2 水凝胶的应用

1.4.2.1 生活日用品

高分子水凝胶由于具有优异的保水性、成膜性等性能，因此拥有一定的增粘、乳化、保湿等功能，因而在应用于皮肤的化妆品领域具有广泛的应用。此外，水凝胶的吸水能力非常优秀，可以吸收高于自身好几倍甚至几十倍的水或生物液体等，因此在卫生材料方面，譬如尿不湿，妇用卫生巾等领域也有着十分广泛的应用。

1.4.2.2 生物医药

水凝胶拥有优异的生物相容性、较小的毒性等特点被广泛用于生物医药领域，比如医用敷料、药物控释、组织工程等方面，其中最成熟的便是医用敷料方面。相比于其他传统的医用敷料，水凝胶价格低廉，具有一定的韧性且表面柔软，可以很好的与伤口贴合；水凝胶可以吸收伤口分泌出的生物组织液防止伤口感染并保存一定的水分，防止伤口结痂；水凝胶由于自身的多孔洞结构可以保持伤口的透气透水，给予伤口良好的恢复环境；而且水凝胶的抗菌性能比较好，可以防止细菌入侵而造成的伤口二次感染。因此，水凝胶在医用敷料方面的有着广阔的研究和应用前景。

1.4.2.3 工业及其他方面

由于水凝胶可以用作食品包装材料、钻井润滑剂、油处理剂、矿业中的抑尘剂等，在工业生产上水凝胶的应用十分的广阔。同样，由于水凝胶的优异性能，在土木建筑、农林园艺、环保等领域也有得到广泛的应用。目前人们对水凝胶的应用拓展也越来越广泛，也可以看出作为一种高分子材料水凝胶的发展前景十分的被人们看好。

1.5本课题的研究内容与意义

水凝胶的分类有多种方式，如果通过制备方法来进行分类，目前主流的水凝胶可以分为物理交联水凝胶、化学交联水凝胶、辐射交联水凝胶。在目前的实验研究中，化学交联制备水凝胶是最为常见的一种制备水凝胶的方式。其方法多是采用一定的小分子化学交联剂或者采用反应分子聚合的方式进行交联。此方法操作简便，且通过控制反应配比便可以对凝胶的生成速率、强度等进行直接调控，但是采用的小分子聚合物一般有毒性。通过物理交联来制备水凝胶主要是依靠氢键、静电力等力的作用来对水凝胶形成束缚，此方法制备水凝胶操作更加简单，并且避免了使用交联剂带来的对皮肤等的毒性与刺激性，通过简便的机械手段即可进行交联，但是物理交联水凝胶易降解，一般来说机械性能较差。辐照交联法水凝胶是目前最为先进的水凝胶制备方法之一，其采用辐照原理在待交联的共混溶液中产生活性粒子，优先引发聚合连锁反应以形成水凝胶，这种方法制备水凝胶不仅反应条件没有要求，而且对医用敷料的无菌要求有着非常强力的保障，但是辐照方法能量消耗高，不适于一般低成本水凝胶的制备生产，还处于研究阶段。

水凝胶是一种处在高速发展状态下的新型功能高分子材料，这类材料在分子期间、调光材料、生物医疗等高新技术领域都将会获得广泛应用。随着研究的不断发展，传统水凝胶在实际应用方面出现了一些不足，而通过改善水凝胶的制备配比、原料等方法能够有效的改善这一现象，制备出性能优良、实用、方便的新型水凝胶。目前市面上也出现了多种具有特殊用途的新型水凝胶，比如电场敏感性水凝胶^[20]、温敏性水凝胶^[21]、光敏感性水凝胶^[22]、PH敏感性水凝胶^[23]等在某一方面具有突出作用的新型水凝胶。

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