产脲酶菌株在处理含Cu（II）废水中的应用及其性能研究开题报告
2020-04-13 14:33:41
1. 研究目的与意义（文献综述）
铜矿开采与冶炼、含铜废水排放和饲料中铜的过量添加使得铜通过各种迁移过程在水体中积累，甚至造成污染。因此，近年来如何修复cu污染废水成为人们关注的焦点。
目前，水体重金属污染修复治理采用以下两条基本途径：一是降低重金属的生物可利用性和在水体中的迁移能力；二是将重金属从受污染水体中彻底清除。主要包括化学沉淀法、化学絮凝法、吸附法和微生物法。其中，化学沉淀法以投加生石灰、naoh等物质的方式，通过控制溶液碱性条件，使cu2 离子以cu(oh)2、cuco3或cus的形式从溶液中分离出来；絮凝法的絮凝剂多为金属盐、微生物胞外分泌物和高分子材料；吸附法则多利用活性炭等多孔性固态物质吸附水中cu2 离子。目前，水体重金属污染处理领域的研究团体对传统方法进行了很大的改进，如研发新型吸附材料、絮凝剂等，但克服其成本高、工艺复杂等缺点，仍然有很大难度。
微生物法由于具有适应快、环境友好、可实现低成本、无二次污染和边生产边修复等优点，在水体污染修复方面受到人们的重视，如利用微生物的细胞代谢过程对重金属进行形态和价态的转化，使其变成低毒、易挥发或易回收形态；以及通过微生物细胞及其分泌物的吸附作用来减低重金属的移动性和可利用性利用微生物的矿化作用将水体中有效态重金属转化成粒径较大和性质较稳定的矿物盐由于生物矿化作用形成的重金属矿物具有粒径大、移动性小和结构稳定的优点，在土壤重金属修复方面具有较高的应用潜力。所以，本课题主要研究产脲酶菌产脲酶菌株在处理含cu2 废水中的应用及其性能研究。
2. 研究的基本内容与方案
| 2、基本内容和技术方案 2.1 试验材料和方法 2.1.1 试验材料 菌种来源：湖北省武汉市洪山区武汉理工大学某花园的红棕壤 2.1.2 试验仪器
2.1.3 培养基组成 (1)液体培养基的组成： 产脲酶菌株筛选培养基：蛋白胨1 g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2 g/L，尿素2g/L，葡萄糖0.1 g/L，酚红溶液(0.2%)4mL/L，20 g/L 琼脂，pH7。其中尿素和葡萄糖分别单独配制为溶液灭菌。 产脲酶菌株生长培养基：蛋白胨1 g/L，氯化钠5 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，尿素2 g/L，葡萄糖0.1 g/L。其中尿素和葡萄糖分别单独配制为溶液灭菌。 LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，氯化钠10 g/L。 淀粉固体培养基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂2 g/L，pH7.2-7.4。 糖发酵培养基：蛋白胨10 g/L，氯化钠5g/L，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1-2ml/L，20%葡萄糖溶液10mL/L。 蛋白胨水培养基：蛋白胨10 g/L，氯化钠5g/L，pH7.6。 葡萄糖蛋白胨水培养基：葡萄糖5 g/L，蛋白胨5g/L，磷酸氢二钾2 g/L，pH7.2-7.4。 以上培养基均在121℃灭菌20min。 2.2 检测方法 2.2.1 OD600的测量 将菌液摇匀，用蒸馏水作参比，在紫外分光光度计上于600nm处测菌液的吸光度。 2.2.2 水中铜离子浓度的快速测定 在pH=9的碱性氨溶液中, 铜离子与二乙基二硫代氨基甲酸钠(铜试剂, 简写为DDTC-Na)作用, 生成摩尔比为1:2的黄棕色胶体配合物。当水样中含铜较高时, 可在水相中直接测定。其最大吸收波长为452 nm, 在测定条件下, 有色配合物可稳定30min。 2.3 实验研究的方法 2.3.1 产脲酶菌株的筛选、分离与保存 称取3份混合好并去除大颗粒杂质的模拟镉污染土壤，每份各0.1g，分别加入到50 ml的尿素溶液（5mol/L）中，再将其倒入锥形瓶（250 ml）中，分别记为1、2、3号富集培养液。将3组富集实验样置于37 ℃、150r/min条件的恒温摇床中，培养24 h。 配制100 ml产脲酶菌株筛选培养基，121℃高压蒸汽灭菌30 min。置于无菌操作台冷却至55 ℃后，分别倒入1-9号平板中，冷却至室温。使用稀释涂布法，以10-6、10-7、10-8三个浓度梯度，将富集好的培养液稀释涂布于制备好的平板上，置于35 ℃恒温培养箱中培养。待平板长出菌落后，挑取菌落周围培养基变红的单个菌落，使用划线分离法接种到产脲酶菌株筛选培养基平板上，35℃条件下培养。重复以上步骤多次，直到分离出无杂菌的单菌株。将纯化分离所得的菌株接种至试管LB培养基后，于-5 ℃冰箱中保存。 2.3.2 菌株的培养和生长曲线测定 在40 ml产脲酶菌株生长培养液加入适量CuCl2，使其Cu2 离子含量为10mg/L，灭菌。分别接种筛选所得的10株菌株后，于120 r/min、37℃的恒温摇床中培养。培养48 h后，培养液的pH使用笔式酸度计检测，培养液中氨氮含量使用苯酚钠-次氯酸钠比色法检测，培养液中尿素含量使用二甲氨基苯甲醛显色分光光度法检测。 取生长情况和产脲酶能力最强的菌株，相同方法接种培养，检测其生长曲线。以OD600（培养液在600 nm波长处的吸光度）表示来表征微生物的生长情况。OD600值为0.2-0.8时，培养液浑浊度与吸光度的线性度较高，吸光度值大于这一范围，可适当稀释。检测菌株生长曲线时，每2 h检测一次，培养24 h后改为6 h一次。OD600的测量采用紫外-可见分光光度计测量，同时辅以浊度仪检测培养液浊度。该菌株的微观形态镜检使用荧光显微镜，生理生化试验参照《常见细菌系统鉴定手册》。 为了研究菌株生长过程中，分泌脲酶的能力变化情况，本研究在检测菌株生长曲线的同时，每2 h检测培养液电导率值、pH、氨氮和尿素含量，培养24 h后改为4-8 h一次。使用精密电导率仪检测培养液的电导率。 2.3.3 菌株生长条件优化实验 为了确定产脲酶菌株的最优产脲酶生长条件，本研究先使用单因素实验确定菌株生长过程中最佳碳源和磷源，以及培养液pH、温度和溶氧量的最佳范围，然后使用正交实验，进一步探究这几个条件间的相互影响关系，最终确定该菌株的最优产脲酶生长条件。 单因素实验参照表2-1，改变培养过程的条件，培养筛选出的产脲酶能力最强的菌株。培养48 h后，检测各组培养液氨氮含量、pH和OD600。
表2-1 单因素实验
为了进一步考察各因素之间的相互影响和各因素水平变化对菌株产脲酶性能的影响，本章选取L16(45)的正交实验，如表2-2所示。采用极差分析法分析实验结果，并判断在产脲酶菌株对尿素的水解过程中，各因素影响程度的主次顺序。 表2-2 正交实验L16(45)的因素和水平
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3. 研究计划与安排
1-2周：资料检索、收集，文献查阅、整理；确定实验方案，撰写开题报告；
3-4周：准备实验仪器与药品，完成土壤采样；
5-13周：完成产脲酶微生物的筛选与分离，优化分离的细菌的生长条件，测定在最佳条件下的产脲酶活性，同时探究其对水体中铜离子成矿能力；
4. 参考文献（12篇以上）
[1] 李婧，周艳文，陈森，等．我国土壤镉污染现状、危害及其治理方法综述[j]．安徽农学通报，2015（24）：104-107．
[2] wu h, song z, wang x, et al. increasingco2 differentially affects essential and non-essential amino acidconcentration of rice grains grown in cadmium-contaminated soils [j].environmental pollution, 2016, 216: 86-94
[3] wu h, song z, wang x, et al. increasingco2 differentially affects essential and non-essential amino acidconcentration of rice grains grown in cadmium-contaminated soils [j].environmental pollution, 2016, 216: 86-94.
