1、目的及意义

土壤盐碱化是世界旱作农区突出的生态环境问题。据统计，盐碱土资源遍及世界100多个国家，总面积达10亿。土壤盐碱化的防治与盐碱土的开发利用已成为社会经济发展、推进可持续进程的重要研究内容。我国约有9913万 的盐渍土，其中现代盐渍化土壤3693万，残余盐渍化土壤4487万。此外，潜在盐渍化土壤约1733万，主要分布于东北、华北、西北内陆地区以及长江以北沿海地带。修复盐碱化土地，可以用多种措施比如工程改良措施、农艺改良措施、生物改良措施、化学改良措施等几种方法。盐碱地改良的生物措施被公认为是改良、开发、利用盐碱地的最有效途径之一。而改良的最终目的也是为了提高土地利用率以及增加经济效益。因此，用微生物法不仅可以改良土地盐碱度，还能将其中的高纤维物质降解提高土壤营养。

1984 年，orikoshi 分离一株产碱性纤维素酶的菌株,完成了该菌碱性纤维素酶组分的纯化工作，并研究了酶的催化性质。曾艳等从西藏扎布耶茶卡盐碱湖中分离到一株产木聚糖酶的嗜碱菌(Bacillus sp .)ZBAW6。该菌株分离到的木聚糖酶在高温、高盐、碱性条件下具有较高的酶活性。武汉大学张甲耀等从含木质素的碱性土壤和黑液中分离、诱变、筛选出了一株能优先降解木质素的嗜碱木质素降解菌，比常用的白腐真菌降解木质素效率要高。

然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下，从而造成生产成本过高。因此，筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。

2、基本内容和技术方案

2.1 试验材料和方法

2.1.1 试验材料

菌种来源：山东东营某盐碱化土壤

2.1.2 试验仪器

A360型紫外可见光分光光度计；TDL-40B型低速离心机；MODEL868pH计；QYC-200型恒温培养箱；THZ-82型恒温摇床

2.1.3 培养基组成

羧甲基纤维素：CMC-Na 5g/L； 1g/L; 0.5g； 0.5g/L； 1%；

刚果红鉴定培养基： 0.2%； 0.05%； 0.1%； 1%；琼脂 2%；刚果红 0.02%；CMC-Na 2%； 0.05% pH自然

富集培养基（1L）：CMC-Na 10g； 1g； 0.1g ； 0.1g； ；蛋白胨 10.0g；酵母膏 5.0g； 1% pH自然

Hutchinson滤纸平板：滤纸； 1.0g； 0.3g； 0.1g； 0.1g； 2.5g； 0.1g；琼脂 20g pH 7.0~7.2

纤维素降解菌鉴别培养基： 2.0g； 0.5g；KH₂PO₄ 1g；CMC-Na 20.0g；琼脂 2.0g；自然pH

2.2 检测方法

2.2.1 产纤维素酶菌株的羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活测定及其复筛

（1）羧甲基纤维素酶活测定取0.5 mL粗酶液，加1 mL CMC—Na柠檬酸缓冲液，混匀后，于50℃水浴30 min，然后加入DNS显色液3 mL，沸水浴10min，冷却，540 nm处测吸光度。同时使用100℃煮沸10 min后失活的酶液做对照，其他步骤相同。

（2）滤纸酶活测定取0.5 mL稀释的粗酶液，加人pH4.8，0.1mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液1 mL，加人一条滤纸(1 cm×6 cm)于带塞试管中，50℃水浴1 h，然后加入DNS显色液3 mL，沸水浴10 min显色，冷却至室温，加蒸馏水定容至10 mI，混匀，静置20 min，540 nm处测吸光度。同时用100℃煮沸10 min后失活的酶液做对照，其他步骤相同。

2.2.2 产纤维素酶菌株的形态学特征

使用革兰氏染色法对菌株进行染色，观察菌株的生长状况，菌丝生长形态，菌落形态进行辨认。

2.2.3 产纤维素酶菌株的产酶条件优化

分析产纤维素酶真菌菌株液态发酵条件下产纤维素酶的影响因素，应用复筛产酶培养基，保持培养基中其他成分不变，在培养温度为25℃的条件下，比较碳源(CMC-Na、葡萄糖、麸皮、、)、氮源、、尿素、蛋白胨、、pH(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)、接种量(1、2、3、4、5mL)及在保持培养基中其他成分不变，改变培养温度(15、25、35、45、55℃)这5个单因素，筛选出影响分离菌株产纤维素酶的最佳单因素。以单因素试验为基础，设计正交试验，探究碳源、氮源和pH值3种因素对羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活的影响，探究最佳发酵产酶条件组合。

实验研究的方法

2.3.1 最优生长条件的探究

首先采用单因素（温度、pH、基源物质）试验，然后根据单因素试验的结果，设计正交实验。通过极差分析，判断各个因子水平影响的强弱程度，确定其关键因素。

参考文献

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