文 献 综 述

1. 选题背景

磷脂酶D的转磷脂酰反应是合成自然界稀有的、高附加值磷脂化合物的最有效途径，这类磷脂化合物是药品，化妆品和食品行业的重要原料，因此磷脂酶大规模工业化生产磷脂酶D一直是迫待解决的问题。
2.磷脂酶D的简介
磷脂酶，在生物体内存在的可以水解甘油磷脂的一类酶，其中包括磷脂酶A1、A2、C和D，在动植物内广泛存在。其中主要包括磷脂酶A1、A2、B、C和D，它们特异地作用于磷脂分子内部的各个酯键，形成不同的产物。这一过程也是甘油磷脂的改造加工过程。
3.磷脂酶D的催化作用
广泛存在于自然界的磷脂酶，在生物过程和生理功能，包括细胞信号传递中扮演了重要角色。磷脂酶是磷脂酶超级家族中的一员，最早在植物中发现，对特殊磷脂表现了磷酸二酯酶活性，这类酶包括心磷脂合成酶，磷脂合成酶，痘病毒包膜蛋白，耶尔森氏小鼠毒素，和几种核酸内切酶。
磷脂酶作为磷酸二酯酶超家族中的一员，是催化磷脂水解第一步反应的关键酶之一，它是一类重要的跨膜信号转导酶类，属于胞外酶，分别由一个基因家族的不同成员编码，广泛存在于微生物，植物和动物中。不仅可以水解磷脂酰胆碱生成胆碱和磷脂酸，也可以催化转磷脂反应，将脂链上伯醇的羟基转移到磷脂酸产物的磷脂酰部分。在哺乳动物中，通过生物化学和细胞生物学方法已确定磷脂酸作为中间体，在胞外信号的传导中发挥重要作用。磷脂酸或其代谢物可能是关键细胞代谢的调控者，如细胞内蛋白质的转运，分泌和细胞形态的改变，运动。
近年来，研究工作者使用了大量的蛋白质工程方法和细胞质基因组表面回声分析来研究磷脂的催化反应机制，底物识别，底物特征和稳定性。

4.磷脂酶D在大肠杆菌系统中的表达
大肠杆菌表达系统，作为重要的原核表达宿主之一，多个课题组尝试将不同来源的磷脂酶D基因整合到大肠杆菌表达系统中，进行异源表达。例如Carlo课题组，从Streptomyces PMF纯化到的磷脂酶D具有高转磷脂酞活性，在1.4Aring;下获得它的晶体学结构(oil，以链霉菌PMF染色体DNA作为模板，以链霉菌antibioticus 磷脂酶D基因序列设计两对异源引物，PCR扩增，最终通过菌落杂交和测序分离得到成熟的，长度约2200bp的链霉菌PMF 磷脂酶D基因。DNA序列分析显示了与己知的磷脂酶D家族其他成员的基因序列有显着的相似性，并存在高度保守的序列，即HKD序列。
E. coli BL21(DE3) pLysE和pET27b( )为表达系统，将PMF-磷脂酶D通过酶切连接的方法构建重组表达质粒pET磷脂酶D，同时以点突变H 167N的磷脂酶D作为阴性对照167位氨基酸是关键氨基酸，突变后磷脂酶D失去活性)，通过N端蛋白测序和WB等方法最终获得阳性转化子pET磷脂酶D，发酵培养时，以IPTG为诱导剂，最终经过蛋白纯化后得到5mg/L的蛋白样品。并用PpNP法测定了磷脂酶D的酶活，最高达到 15mU/ml。
大肠杆菌是目前最为成熟的基因工程菌表达系统，也是最早被用来做异源表达链霉菌磷脂酶D尝试的表达系统，Iwasaki和Nakan。等人早期从链霉菌Streptomyces antibioticus属克隆得到胞外磷脂酶D基因并测序得到该磷脂酶D基因的全序列，通过核酸序列的分析，推测出一个核糖体结合位点和一个开放阅读框，开放阅读框用来编码纯化得到的556个氨基酸的蛋白。该蛋白在大肠杆菌中的表达形成的是不溶性蛋白，但可与磷脂酶D对应的抗体发生反应。用盐酸肌和2-疏基乙醇溶解后的蛋白质，随后的透析恢复了磷脂酶D的活性。比较N-末端的蛋白质的碱基序列，数据表明，合成的分泌蛋白是一个更大的前体，包括了509个氨基酸的成熟蛋白，并在N端又延伸了47个氨基酸。随后也有人做过磷脂酶D在大肠杆菌的表达研究，由于一般都需要诱导剂进行诱导，并且表达量和活性都不高，并不适合用于工业化生产，而是通过浓缩纯化蛋白后，用来研究磷脂酶D的蛋白序列和催化功能等蛋白方面的研究。
为了研究链霉菌磷脂酶D的表达是否对宿主有毒害作用从而影响了蛋白表达，本实验设计了相应引物将原始磷脂酶D基因放入大肠杆菌中进行表达，研究磷脂酶D早大肠杆菌中的表达效果。

5.研究目的及内容
磷脂酶D在生物体内的生物过程和生理功能，包括细胞信号传递中扮演了重要角色，例如真核细胞中，高尔基体囊小泡的形成等。此外，磷脂酶D在产生第二信使时，可以作为一个”活化信号”的酶，在生物合成乙酞胆碱时生成胆碱，参与机体的生理过程和细胞内的信息传递。
利用表达质粒pET-22b( ),将来自色褐链霉菌的磷脂酶D基因(pld)在大肠杆菌中大量表达,然后利用镍亲和纯化柱进行纯化回收,再利用纯化后的重组磷脂酶D作用于底物卵磷脂和丝氨酸定向合成磷脂酰丝氨酸,拟为实现工业化酶法合成磷脂酰丝氨酸奠定基础。
目前，通过生物发酵大量获得真核来源磷脂酶D的尝试，结果都不理想，这些真核磷脂酶D在发酵生产时，要么生成低活性的酶，要么形成与膜结合的状态。放线菌来源的内源性磷脂酶D和植物以及真菌来源的磷脂酶D相比，除具有较高的反应活性外，更兼具转磷脂酞底物选择性高，催化结构最紧密以及在稳定和有机介质稳定性高等方面的优势，更适合应用于工业中磷脂以及磷脂衍生物的高效合成。
本课题利用表达质粒pET-22b( ),将来自色褐链霉菌的磷脂酶D基因(pld)在大肠杆菌中大量表达,利用纯化后的重组磷脂酶D作用于底物卵磷脂和丝氨酸定向合成磷脂酰丝氨酸,拟为实现工业化酶法合成磷脂酰丝氨酸奠定基础。
主要研究内容:
本实验以来源于S.PMF的磷脂酶D基因为模板，通过分子手段导入大肠杆菌BL21DE3，使其能够表达产生磷脂酶D。

参考文献
[1]张莹.在不同宿主中表达链霉菌磷脂酶D的研究[D].华东理工大学；生物化工，硕士，2012.
[2]李斌.色褐链霉菌磷脂酶D基因磷脂酶D的克隆与表达[J].化学与生物工程,2007(5):48-51.
[3]陈明华.链霉菌CPCC202950的化学成分研究[J].中国中药杂志，2015.4（40.7）:1320-1324
[4]黄国强.链霉菌JD211发酵条件优化[J]湖北农业科学，2015.5（54.10）:2470-2482
[5]Fanyan Jiang,Shen Huang,Kaleem Imadad,Chun Li*.Cloning and expression of a gene with phospholipase B activity from paseudomonas fluorescents in Escherichia coli[J]Bioresource technology 104(2012)518-522
[6]Yoshiko Uesugi,Tadashi Hatanaka*.Phospholipase D mechanism using Streptomyces PLD[J]Biochimica et Biophysica Acta 1791(2009)962-969
[7]Sheng Chen,Lin Xu,Yan Li,Ning Hao,and Ming Yan*.Bioconversion of Phosphatidylserine by Phospholipase D from Streptomyces in a Microaqueous Water-Immiscible Organic Solvent[J]Biosci.Biotechnol.Biochem,77(9),1939-1941,2013
[8]Tadashi Hatanaka*,Tomofumi Negishi,Megumi Kubota-Akizawa,Taino Hagishita.Purification,characterization,cloning and sequencing of phospholipase D from Streptomyces septatus THE-2[J]Enzyme and Microbial technology 31(2002)233-241
[9]Yusaku Matsumoto and Daisuke Sugimori*.Substrate recognition mechanism of Streptomyces phospholipase D and enzymatic measurement of plasmalogen[J]Journal of Bioscience and Bioengineering VOL.120 No.4,372-379,2015
[10]Ji-Seon Lee,Munkhtsetseg Bat-Ophir,Atanas V.Demirev,and Doo Hyundai Nam*.Molecular Cloning of the Phospholipase D Gene from Streptomyces sp.YU100 and Its Expression in Escherichia coli[J]The Journal of Microbiology(2009)166-122
[11]Carlo Zambonelli,Papla Morandi,Maria Antonietta Vanoni,Gabriella Tedeschi,Stefano Servi,Bruno Curti,Giacomo Carrea,Rossana Di Lorenzo,Daniela Monti.Cloning and expression in Escherichia coli of the gene encoding Streptomyces PMF PLD,a phospholipase D with high transphosphatidylation activity[J]Enzyme and Micribial Technology 33(2003)676-688
[12]Jaya Ram Simkhada,Seung Sik Cho,Hong Seok Choi,Si Wouk Kim,Hei Chan Lee,Jae Kyung Sohng,andJin Chelsea Yoo.A New Thermolabile Alkaline Phospholipase D from Streptomyces sp.CS628[J]Biotechnology and Bioprocess Engineering 15(2010)595-602