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摘 要

近年来，利用生物素和亲和素之间高度的亲和力，以及他们既可偶联抗体等大分子生物活性物质，又可以被酶等多种材料标记的特性，研制成一种新型生物反应放大系统，即生物素-亲和素系统（BAS)，藉以建立多种高灵敏度、高特异性、高稳定性、方便易行的生物反应检测和分离提存手段。它已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。但实际应用中存在着生物素化目标检测物在溶液中容易团聚,不能与标记亲和素充分接触的弊端，导致检测灵敏度和效率不够高，为了解决这个问题，本文就一种新型的高效检测体系，纳米级的章鱼状结构的生物素化环三聚磷腈的构建、表征和性质测试进行论述。

关键词：生物素 亲和素 六氯环三磷腈 生物探针

Preparation and application research of a Phosphonitrilic chloride trimer ramification biosensor

Abstract

During the past decade, there has been explosive growth in studies of Biotin-Avidin—System(BAS), Biotin and avidin can not only linked with Macromolecular bioactive substances, but also marked by enzyme and other materials.So BAS could be used as a high-efficiency detection method in many fields, such as the detection of micro immunofluorescence, and antibodies  qualitatively and the new technology in positioning observation study, which due to it is equiped with excellent Properties , high sensitivity, high specificity, high stability, convenient. However, when applied in solution,it is easy to reunite and can’t contact with avidin adequately. So in this paper, Biotinylated cyclotriphosphazenes polymer (g-BTP) biosensor with germinal octopus-like molecular shape was prepared, characterized and property tested.

Key Word：Biotin;avidin; Phosphonitrilic chloride; Biosensor

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1生物素-亲合素系统 1

1.1.1 生物素 1

1.1.2 亲和素 1

1.1.3生物素亲合素系统 1

1.1.4生物素亲和素系统的特点 2

1.2六氯环三磷腈 3

1.3 研究目的和意义 4

第二章 实验材料与方法 6

2.1 实验材料 6

2.1.1 实验试剂 6

2.1.2 实验设备 8

2.2 实验方法 9

2.2.1 g-TP的合成 9

2.2.2 g-BTP的合成 9

2.2.3产物的表征 9

2.2.4应用测试 10

第三章 结果与分析 11

3.1 g-BTP的合成与表征 11

3.2 HNMR 12

3.3粒径分析 12

3.4绑定动力学比较与分析 13

第四章 结论与展望 15

4.1 结论 15

4.2 展望 15

参考文献 16

致 谢 18

第一章 文献综述

1.1生物素-亲合素系统

1.1.1 生物素

维生素H又称生物素、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族，B7。它是合成维生素C的必要物质，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质。是一种维持人体自然生长和正常人体机能所必须的水溶性维生素；是代谢脂肪及蛋白质不可或缺的物质，也是维持正常成长、发育及健康必要的营养素。可与多种标记物如酶、荧光素、同位素、凝集素、铁蛋白、核酸等结合。这些生物活性物质在生物素化后，其结合不会受到显著影响^[1]。如抗体分子经生物素化后，其结合抗原的活性不受影响。同样多种酶经生物素化，其催化活力也保持不变或稍有降低。

1.1.2 亲和素

亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，具有4个生物素分子亲密结合位点，可以和4个生物素分子亲密结合。亲合素主要包括卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素等。后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已深入研究并得到广泛应用。亲和素可以和4个生物素分子亲密结合，这虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。且由于多种生物活性物质在生物素化后，其活性不会受到显著影响，故而二者在结合反应时具有的多级放大作用^[2]。

1.1.3生物素亲合素系统

生物素－亲合素系统（Biotin-Avidin—System，BAS）是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域^[3]。

1979年Guesdon利用生物素和亲合素间具有高度亲合力的特点，建立了标记亲合素和生物素法（LAB／BA）与桥联亲合素—生物素技术（BRAB）^[4]。1981年Hsu首次报告了改进的亲合素—生物素—过氧化酶复合物法（ABC法）^[5]。近年大量研究证实，生物素—亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合，如酶、荧光素、同位素、凝集素、铁蛋白、SPA等。生物素—亲合素与标记试剂高亲合力的牢固结合及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。BAS已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术^[6]。

BAS用于检测的基本方法可分为三大类。第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为BAB法，或桥联亲和素-生物素法(BRAB)。第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体
接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。尽管方法很多，但在目前国内主要还是BAS-ELISA法。特别是其中的BA法和ABC法用得较多。至于其它标记材料(如荧光素、铁蛋白和血蓝蛋白等) 的BAS检测系统，只要制备或得到了相应标记物，再根据BAS的基本原理及基本方法即可自行探索建立实验程序^[7]。

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