论文总字数：21243字

摘 要

为进一步拓展耐有机溶剂蛋白酶在催化领域中的应用，本课题主要将本实验室具有自主知识产权的蛋白酶MH6与嗜热蛋白酶进行结构比对，选择合适的突变位点，使用定点突变技术，定点的改造耐有机溶剂蛋白酶MH6。使得改造后的耐有机溶剂蛋白酶MH6在催化合成阿斯巴甜前体苄氧羰基阿斯巴甜时具有更高的催化效率。

本课题以苄氧羰基天冬氨酸（Cbz-L-Asp）和苯丙氨酸甲酯盐酸盐（PheOMe.HCl）为底物，合成苄氧羰基阿斯巴甜(Cbz-APM)。主要研究了反应体系中有机溶剂的浓度，两个反应底物的浓度和反应体系的pH对于合成阿斯巴甜前体苄氧羰基阿斯巴甜时的产率的影响。对于将酶法合成阿斯巴甜应用到工业生产上具有极大的指导意义。

关键词：蛋白酶MH6 定点突变 酶催化 反应分离耦合 苄氧羰基阿斯巴甜

The molecular transformation of Protease MH6 based on the synthesis of aspartame

ABSTRACT

In order to expand the application of the protease in catalytic, the subject mainly through compared protease MH6 with thermolysin. And the suitable animo residues were found. And the mutants of MH6 were gotten by site-directed mutagenesis. Finally, the moutant which had higher catalytic efficiency of the catalytic synthesis of aspartame was gotten by experiments.

In this report, the Cbz-aspartame was gotten by enzyme catalyzed syntheses from benzyloxycarbonyl aspartic acid (Cbz-L-Asp) and phenylalanine methyl ester hydrochloride (PheOMe.HCl). A lot of factors were studied in this study, such as the concentration of organic solvent in the reaction system, pH concentration of the two reaction substrates, and the reaction temperature. Finally the best reaction conditions were found. And all of these factors make the aspartame up-scale production with enzymatic catalysis by protease MH6 and mutated protease will come true in the future.

Key words:Protease MH6; site-directed mutagenesis; enzyme catalysis; separation coupling reactions; Z-aspartame

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1阿斯巴甜介绍^[1-5] 1

1.1.1阿斯巴甜的理化性质^[1-5] 1

1.2阿斯巴甜合成方法 2

1.2.1化学合成法 2

第二章 耐有机溶剂蛋白酶MH6的分子改造 5

2.1前言 5

2.2实验材料 5

2.2.1菌株及质粒 5

2.2.2试剂 5

2.2.3实验仪器 6

2.2.4培养基配方 7

2.3实验方法 8

2.4结果与讨论 13

2.4.1核酸电泳 13

2.4.2阳性重组子的鉴定 13

2.4.3SDS-PAGE检测蛋白 14

2.4.4蛋白酶活比较 14

2.5本章小结 15

第三章 蛋白酶MH6及其突变体催化合成阿斯巴甜前体 16

3.1前言 16

3.2实验材料 17

3.2.1酶制剂 17

3.2.2试剂 17

3.2.3仪器 17

3.3实验方法 18

3.3.1耐有机溶剂蛋白酶MH6突变体催化合成阿斯巴甜的简易流程图 18

3.3.2耐有机溶剂蛋白酶MH6突变体催化合成阿斯巴甜前体 18

3.3.3耐有机溶剂蛋白酶MH6突变体催化合成阿斯巴甜前体的条件优化 18

3.3.4阿斯巴甜前体催化加氢生产阿斯巴甜 21

3.4结果与讨论 21

3.4.1蛋白酶MH6突变体催化合成Cbz-Asp-PheOMe反应体系中DMSO含量影响 21

3.4.2蛋白酶MH6突变体催化合成Cbz-Asp-PheOMe反应体系中底物浓度影响 22

3.4.3蛋白酶MH6突变体催化合成Cbz-Asp-PheOMe反应体系中pH的影响 24

3.5本章小结 26

第四章 结论和展望 27

4.1结论 27

4.2创新点 27

4.3展望 27

参考文献 28

致 谢 29

附 图 30

第一章 文献综述

1.1阿斯巴甜介绍^[1-5]

1.1.1阿斯巴甜的理化性质^[1-5]

阿斯巴甜(Aspartame，APM，C₁₄H₁₈N₂O₅)，化学名称为N-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯，国外商品名为Nutrasweet，国内商品名为蛋白糖。由美国G.D.Searle公司的研究人员在合成促胃液分泌激素时偶然发现其甜味，成为二肽类中第一个被发现有甜味的物质。它具有氨基酸的一般特性，等电点pH5.2，呈白色粉末或结晶，在水中的溶解度为1g/100ml（20℃），阿斯巴甜的含热量为16.72千焦耳/克，与蔗糖类似但在获得同等甜度的情况下其需求量只是蔗糖的1/200，可作为非营养型甜味剂。在常温、弱酸(pH为3~5)条件下十分稳定，在强酸强碱及中性水溶液中易水解生成苦味的苯丙氨酸或二嗪哌酮，因此，苯酮尿症患者不能服用。阿斯巴甜在体内能很快消化成3个组分:天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇，然后被吸收。自1981年美国食品和药品管理局核准通过使用后，目前，该甜味剂已经在100个国家及多个权威机构认可，我国于1986年正式批准其在食品中使用。目前，阿斯巴甜已经发展成为国际市场上的主导强力甜味剂。

1、低热量、高甜度、甜味纯

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