1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

人参是常见的补益中药,应用于中医临床已有2000多年的历史 ,具有广泛的药理作用和医疗用途 。人参中主要的生理活性成分是各种人参皂苷 ,其基本骨架，见（图 1），已鉴定结构的人参皂苷有 60 多种，其中大多数属于原人参二醇类皂苷 ,主要包括人参皂苷 Ra1、Ra2、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg3、Rh2等 ,是人参的主要活性成分之一。人参皂苷的生理活性,决定了它的食用和药用价值。人参口服之后,其皂苷糖基被肠道菌和消化系统的酶水解成低糖基的皂苷, 吸收起药效, 如 Rb1口服后转化为人参稀有皂苷C-K。但是这种体内的转化受到个体各种因素的约束, 转化微量 。总的来说，人参皂苷具有多种药理功能：免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗过敏、抗动脉粥样硬化、抗应激、抗糖尿病、抗增殖、抗遗传毒性和抗高血压以及神经递质的调节作用等。稀有皂苷的高药学活性为他们在工业和医疗领域的应用创造了一个可用性需求。然而，他们的规模，跨越细胞膜的溶解性低、渗透性差，是人体难以吸收大量的人参皂苷的直接原因 ,因为这些成分是人参总皂苷的主要部分。因此，将主要人参皂苷去糖基化生产稀有人参皂苷的转化生产不仅促进各类稀有皂苷的生产也加速了对稀有人参皂苷生物学和药理学的性质研究。

一、参皂苷的合成方法

1.1化学合成法

在糖的合成化学中，糖苷化反应是最基本的反应。传统的糖苷化反应是将一个糖的异头位衍生得到糖苷化给体与具有裸露羟基的底物称为受体，经过糖苷化反应形成缩醛键连接起来，形成一个新的糖苷键，见（图 2）。糖苷化反应主要涉及到区域选择性、立体选择性和收率，影响糖苷化反应的因素很多，其中给体、受体和促进剂是3个主要因素，其他反应条件如溶剂、温度和浓度等对其都有影响。

1.2酶解法

化学合成法的反应条件复杂，产率低，对催化剂、反应温度等要求极高，这些都严重的制约了人参皂苷在工业上的放大合成。相对于化学合成法，Chung 等、Keegstra 等 研究表明酶解法具有反应条件温和，对底物区域和立体选择性好等优点，酶解法的出现极大的弥补了化学合成的不足，人参皂苷在肠道菌中的转化 Qian T X 等 利用大鼠肠道菌群来研究人参皂苷Ｒb1，Ｒg3和Ｒh2在大鼠胃肠道中的生物转化过程，结果研究表明，人参皂苷Ｒb1，Ｒg3，Ｒh2分别经大鼠胃肠道菌群生物转化后，可以分别在大鼠排泄物样品中检测到代谢产物，其中人参皂苷Ｒg3和人参皂苷Ｒh 2均可由人参皂苷Ｒb1在大鼠胃肠道经生物转化获得，Ｒh2可以由Ｒg3生物转化获得。研究表明主要人参皂苷Ｒb1可以通过胃肠道菌群的共同生物转化产生活性更高的稀有人参皂苷 Ｒg3和Ｒh2。陈新梅 对人参皂苷Ｒg1在大鼠肠道酶和菌群的代谢转化进行了研究， 发现人参皂苷Ｒg1在人工胃液中 2 h 可完全降解， 在大鼠肠内菌群的代谢下可转化为一对同分异构体人参皂苷Ｒh1和人参皂苷F1。

三七总皂苷在三七自身皂苷糖苷酶作用下的转化刘廷强等通过改变提取三七总皂苷的温度，利用三七自身所含有的皂苷糖苷酶，将三七所含有的主要人参皂苷如Ｒb 1，Ｒe，Ｒd，Ｒg1等转化为稀有人参皂苷如Ｒg3等。其研究发现人参皂苷可耐受 80 ～121 ℃而不分解， 但在三七提取过程中， 将温度设置在 80 ～100 ℃时可以将 15%的三七总皂苷(Ｒb，Ｒd，Ｒg 1，Ｒe 等)转化为稀有人参皂苷(Ｒg2，Ｒg3，Ｒh2，C- K 等)， 而通过提高温度至 110 ～121 ℃时可完全转化为稀有人参皂苷。

1.3微生物转化法

微生物转化合成法相对于化学合成法和酶解法具有反应条件温和，转化效率高，副产物少，产物接近天然，无环境污染等特点。由于通过微生物转化往往能得到化学合成难以获得的新颖结构，此技术在中药的研究和创新中已显得越来越重要。

微生物转化法糖苷化实例见表 1。

表 1 微生物转化法糖苷化实例

Table 1 Examples of microbial transformation glycosylation

1.4酶法合成人参皂苷

作为植物萜类化合物, 人参皂苷生物合成途径一般可划分为三个阶段: ( 1) 以糖酵解产物乙酰辅酶 A作为原初供体, 经过甲羟戊酸 (Mevalonate)中间物合成异戊 烯 焦 磷 酸 ( IPP ) 和 二 甲 基 烯 丙 基 焦 磷 酸(D MAPP); (2) 通过烯丙基转移酶 ( prenyltransferase)和萜类环化酶的催化合成 2, 3- 氧化鲨烯; (3) 2, 3- 氧化鲨烯依次经过环化、 羟基化、 糖基化对三萜碳环骨架进行复杂修饰, 最终形成达玛烷型和齐墩果酸型人参皂苷。转化过程，见（图3）。

本课题分析合成活性稀有人参皂苷的糖基转移酶基因的序列特异性及对底物的选择特异性，设计引物，获得原核生物来源的功能糖基转移酶的基因，优化并构建糖基转移酶的高效表达体系，验证其催化功能。为解决稀有萜类糖苷产物的资源问题提供积极的借鉴作用，对于选择性地获得具有较高价值的人参皂苷具有重要意义。

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

需解决的问题：

1.产糖基转移酶筛选菌株的菌种鉴定。

2.糖基转移酶基因的克隆以及表达载体的构建。