1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

一、生物被膜 生物被膜又称生物膜，是由微生物及其胞外基质（eps）在生物或非生物介质表面形成的致密、复杂的生物聚集体 。

在自然界，生物膜是微生物最为普遍的存在形式之一，超过90%的细菌可以以生物膜的形式存在 ，超过80%的细菌性感染疾病与生物膜有关。

早在17世纪，荷兰显微镜学家antony van leeuwenhoek 便从牙菌斑中观察到了细菌生物膜的存在 ，这是最早有关细菌生物膜的科学研究。

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

一、研究解决的问题：酿酒酵母基因敲除 二、研究手段：lfh一pcr(长侧翼同源pcr,也叫两步pcr)方法 本方法采用四条引物:引物ll、l2、l3、l4,其中ll、l4中的碱基与需要敲除的酵母基因上下游序列的碱基完全互补,l2、l3引物的3'碱基序列与需要敲除的基因序列完全互补,5'碱基序列与扩增筛选标记基因序列是反向互补的。

第一步pcr以酵母基因组为模板,l1、l2与l3、l4引物对分别扩增目的基因的上下游同源序列;第二步pcr以带有抗性标记基因的质粒dna为模板,第一步pcr产物及ll、l4为引物进行重叠延伸pcr,扩增产物为两端带有敲除基因同源序列的抗性基因片段,产物的同源序列长度由两对引物ll、l2和l3、l4之间的距离决定通过lfh一pcr方法构建基因敲除组件中的目的基因同源序列的长度远远大于sfh一pcr方法得到的同源序列的长度,其通过同源重组大大增加了定点整合的机会,而且保证了转化子的稳定性。

本研究采用长侧翼同源两步pcr(lfh一pcr)方法构建flo1, 5,9,10等基因敲除组件。