文 献 综 述

重组质粒p-delta-ICP47的构建

重组质粒构建的目的为建立获得简便、可靠的目的基因序列的方法。有目的基因，有质粒，然后用酶使两者相接就是重组质粒。应用菌落pcr对转化菌进行筛选和DNA序列分析。首先从基因序列设计开始，到初步pcr扩增，将扩增所得基因导入目的载体puc57，经连接转化等步骤，使其在显色培养基上长斑，通过蓝白斑筛选挑取阳性克隆，克隆载体和表达载体筛选及鉴定采用与载体多克隆插入位点序列互补的通用引物。筛选出的阳性菌落通过送测至测序部进行序列比对、分析，获得最终想要的正确质粒克隆。

PCR反应及其引物设计

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，可认为是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95#176;高温时变性会变成单链¹，低温（经常是60#176;C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72#176;C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列²。第一步，我们需要对PCR引物进行设计，设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。一般引物序列中G C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布是随机的。如果有聚嘌呤或聚嘧啶存在，那么引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

复制体

绝大多数的生物都是以DNA的形式来储藏其遗传信息。遗传物质要能生生不息地传给后代的首要条件就是它至少要具有一个复制原(ori, origin of replication，或译为复制起点)，使整个基因体得以复制³。含有复制原的遗传物质称为replicon，称为复制体。原核性复制体分为原核染色体、质粒(plasmids)和噬菌体基因体(phage genome)等三类。其中质粒的基因体和原核染色体类似，是由双绞炼DNA构成，并以超卷曲的形式存在。它们的基因体约由2,000至150,000个碱基对组成，绝大多数呈环状，但也有极少数是线状构造(如Borrelia burgdorfferi)。事实上你可以把它们视为比较小的原核染色体。在自然环境中它们相当普遍地生存在原核生物细胞内，并和其宿主的许多特殊功能有关，诸如：赤贺氏杆菌(Shigella)的抗药、根瘤菌(Rhizobium)的固氮、农杆菌(Agrobacterium)的引瘤及假单胞杆菌(Pseudomonas)对环状有机物的分解等等。

筛选阳性克隆

连接反应是基因合成实验中的重要操作步骤，操作质量关系着后续工作的顺利进行⁴。因此，制作本细则规范连接操作，从而使基因合成顺利进行。