文 献 综 述

1. 前言

甜菊糖是从菊科草本植物甜叶菊叶中提取的天然、安全、健康的甜味剂。它是30多种糖甙的混和物，不同糖甙在味质上存在较大的差异。甜菊糖总甙中两种主要成分是甜菊甙（Stevioside, St甙）和莱鲍迪甙A（Rebaudioside A, RA甙）^[1,2]。一般St甙和RA甙分别占甜叶菊叶片干重的5#8211;10% 和 2#8211;4%^[3,4]。RA甙比St甙甜，且甜味纯正、无不良口感，是一种最为理想的蔗糖替代品^[5，6]。而现在一般市售的甜菊糖中St 甙为主要组分，其略带甘苦味，影响了甜菊糖的口感。因此，提高RA 甙在甜菊糖总甙中的相对含量有助于改善甜菊糖味质。

莱鲍迪甙A是一种无毒、安全、低热能、高甜度的天然甜味剂，口味纯正，没有后苦味。2008年，美国食品和药物管理局（FDA）认可RA甙属于一般公认的安全类添加剂（GRAS）。近年来，已有多种将RA甙从甜菊糖中分离出来的方法，例如，高速逆流色谱法，制备HPLC和吸附分离法^[7-10]，以制备高纯度的RA甙产品。

甜叶菊中甜菊糖甙的部分合成途径已解析清楚^[11]。St甙到RA甙由UDP-糖基转移酶UGT76G1催化的一步糖基化反应完成^[12,13]。最近，另一条为与UGT76G1序列相近的基因的功能得到确认，命名为UGTSr^[14]。尽管如此，由天然UDP-糖基转移酶含量甚微，分离纯化成本高，无法满足大规模生产的需要，且其催化的葡萄糖基转移反应还需要以昂贵的尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-葡萄糖）作为糖基供体，致使酶活催化 St甙合成RA甙的经济性差、缺乏市场竞争力。甜叶菊糖基转移酶 UGT76G1 能催化甜菊甙生成莱鲍迪A 甙。在酿酒酵母中，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)主要催化UTP和葡萄糖-1-磷酸合成UDPG，在糖代谢过程中起着重要作用。为了提高细胞的UDPG合成能力，本课题计划应用同源重组技术在酿酒酵母基因组上整合表达UGT76G1和UGPase，赋予酿酒酵母同时表达糖基转移酶和葡萄糖焦磷酸化酶的能力。再以重组的细胞为催化剂，利用简单的糖源，过表达UGPase增加UDPG糖基供体量，并在糖基转移酶的作用下，以甜菊甙为底物合成莱鲍迪甙A。

2. UDP-糖基转移酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的简介及应用

2.1 UDP-糖基转移酶

2.1.1UDP-糖基转移酶的简介

糖基转移酶 (Glycosyltransferases, GTs) 存在于所有活的有机体中，负责催化糖基转移反应，将活化的糖基供体的糖基团转移到受体分子上。糖基供体分子包括双糖或多糖、1-磷酸糖、核苷 -2-磷酸糖、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸。哺乳动物最常见的糖基供体为尿苷二磷酸葡萄糖醛酸，植物中最常见的糖基供体除尿苷二磷酸 (Uridinediphosphate, UDP) -葡萄糖，还有 UDP-半乳糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和 UDP-葡萄糖醛酸。因此，糖基转移酶一般被称为尿苷二磷酸#8212;糖基转移酶 (UDP-glycosyltransferases, UGT)。糖基受体除了单糖、低聚糖和多糖外 , 还包括非碳水化合物，如蛋白质、脂质、抗生素、固醇、酚类物质、萜类、氰醇、植物激素、生物碱、植物毒素、外源物质如除草剂和杀虫剂，其糖基化部位在受体分子的O(-OH, -COOH)、N(-NH 2 )、S(-SH)和 C(C-C)原子上，生成相应的糖苷或糖酯。^[15]