文 献 综 述

1. 概述

T4噬菌体溶菌酶常用作研究蛋白质的结构和稳定性的模式蛋白。前人对T4噬菌体溶菌酶的突变位点对酶的热力学性质和晶体学性质的影响做了许多研究，得到了关于突变与酶热力学和晶体学性质的大量数据。我们发现，尽管对于单个突变数据有相关的生物学意义上的解释，但缺少一种能够解释大部分数据的理论。

2. 溶菌酶结构

蛋白质的结构决定了其相关的性质和功能。我们已经知道很多关于野生型T4噬菌体溶菌酶的信息。通过高分辨率（0.98Aring;）的蛋白质结构的测定，可以得到野生型溶菌酶蛋白的详细的结构（3FA0）。^[1][2]其一级结构为156个氨基酸组成的氨基酸序列，二级结构主要是α螺旋和β折叠，其中α螺旋占多数，三级结构从蛋白质一级结构的两端分为两个主要的结构域。C端的结构域是多个串联的α螺旋，N端的结构域是一个较小的α螺旋和β折叠的串联，两个结构域之间通过一个较大的α螺旋相连。根据对蛋白质催化行为的模拟，该α螺旋在蛋白质催化的运动过程中可能起着关键作用。三级结构整体类似于一种夹子，中间有一个”沟”，用于容纳被催化的底物肽聚糖链。

3. 溶菌酶催化机理和关键位点

T4噬菌体溶菌酶催化的机理是：通过其两个结构域之间的”沟”结合到肽聚糖分子上，使得其底物在酶中形成过渡态的构象，然后根据Phillips机制，T4噬菌体溶菌酶与葡聚六糖结合，将葡聚六糖上的第四个糖扭曲为半椅型构象，由于这种扭曲状态的能量较高，糖苷键很容易发生断裂。该酶的催化属于广义酸碱催化和静电催化，其氨基酸侧链35位的谷氨酸（Glu35）和52位的天冬氨酸（Asp52）对酶的活性起着关键的作用。Glu35作为糖苷键的质子供体，切割底物中的C-O键，而Asp52作为亲核体产生糖基酶中间体，然后糖基酶中间体与水分子反应，得到水解产物，酶恢复原来的结构。

4. 突变位点的耐受性

早期的研究发现了溶菌酶蛋白对氨基酸位点突变具有很强的耐受能力。这其中最突出的研究是由Poteete及其同事^[3]完成的。他们采用13种不同的氨基酸对溶菌酶的164个位点进行了替换，并通过溶菌酶对菌株的抑制效果来展示溶菌酶的活性。值得注意的是，超过50%的位点的13种突变都对蛋白质的活性几乎没有影响。这些耐受突变的位点大规模的分布于蛋白质的表面。这种现象与蛋白质折叠的原理相符合：折叠好的蛋白质表面的氨基酸残基部分或全部暴露在溶剂中，而这些残基在未折叠的蛋白质中也是暴露在溶剂中的。由于折叠前后所处的环境几乎相同，所以这些残基对蛋白质高级结构的稳定性没有太大的贡献。因此，这些残基即使被替代了，也不会对蛋白质的活性造成显著的影响。他们还发现即使是在蛋白质的核心，有些位点对许多替换也具有极高的耐受性，导致这种耐受性的原因还不得而知。

5. 突变位点与蛋白溶解温度

位点的突变会造成酶的稳定性的变化，评价酶稳定性的一个热力学指标是溶解温度。对于溶菌酶，很少单点突变可以使酶的溶解温度上升超过3到4摄氏度，但是有许多单点突变可以使酶的溶解温度下降超过3到4摄氏度。其中，使酶稳定性下降最多的一些单点突变导致酶的溶解温度下降了20摄氏度。这些单点突变包括引入带电侧链进入酶疏水核心的M102K(1L54)、位于蛋白高级结构核心的小氨基酸到大氨基酸的A98F和A98W、位于蛋白高级结构核心的大氨基酸到小氨基酸的L99G(1QUD)。他们还发现，导致侧链上多个与精氨酸有关的作用力消失的R95A单点突变显著地降低了酶的稳定性。总的来看，单点突变只能轻微的增加溶菌酶蛋白的稳定性，未显示出有显著改善溶菌酶蛋白稳定性的能力。

6. 突变导致局部结构的重排

在绝大数情况下，点突变造成温和的、局部的结构变化。组合这些点突变可以产生较大的结构的变化，从而产生空腔或者重新包裹核心部位，也会导致相对适度的结构重排。突变引起局部结构的改变，其中骨架的转移比较常见，而旋光性的改变比较少见。Baldwin等人^[4]，利用遗传筛选的方法来选择能包裹蛋白疏水核心的替换的组合。这些替代的残基大部分都是导致碳骨架的局部调整，很少会造成旋光性的改变。Hurley等人^[5]利用基于Ponder和Richards^[6]的算法的计算程序来寻找残基Leu99、Met102、Val111和Phe153。他们发现突变体L99F/M102L/V111I/F153L (1L82)的碳骨架转移了0.6到1.0Aring;。这超出了预期。相似的是，Dahiyal和Mayo^[7]利用计算程序预测可以替代的核心包裹的序列。结构确定再次表明设计的序列主要导致碳骨架的转移（达到2.8Aring;）而不是旋光性改变。虽然使用固定的碳骨架来计算可以简化计算量，但是溶菌酶的例子表明该计算是对真实蛋白的较差的近似。

7. 累积突变和活性位点的突变效应

通过组合各种突变的效应，构建了突变体I3C/I9C/T21C/C54T/T142C/L164C ox.^[6,8]，从而在溶菌酶蛋白中引入了三个二硫键，使酶的溶解温度增加了23.4摄氏度，显著的提高了酶的稳定性，但是酶也失去了催化活性。有些突变位点的效果是可以累积的，而有些是不可以的。其中累积突变体I3L/S38D/A41V/A82P/N116D/^[9]使酶的溶解温度增加了8.32摄氏度，但是酶的催化活性仅剩下2%。单个位点的突变还可能改变蛋白质螺旋的倾向，突变体S38D^{[9,10,11 ,12]}使酶的溶解温度增加了1.6摄氏度，但是酶活只有野生型的80%。我们还发现，对于包埋赖氨酸的突变体M102K/WT*^[13,14]，其酶活只有野生型的35%，而溶解温度下降了20.3摄氏度，说明该位点可能是关键位点。有些残基的改变导致了稳定性的增长，说明在原本的蛋白中，这些残基导致了稳定性的下降。比如117位的丝氨酸^[15]和132位的天冬酰胺^[16]，与Shoichet等人^[15]的假设相符合，这两个残基与酶和底物的结合有关，因此为了活性而牺牲了稳定性。替换掉这两个氨基酸会导致活性的增加，但是这是以酶活性丧失为前提的。实验数据很好的验证了这个猜想。

8. 参考文献

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