1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

核苷酸是生物体内的一类重要含氮化合物，是各种核酸的基本组成单位。几乎在所有的细胞结构、代谢、能量和调节功能方面都需要核苷酸.故无论在农业^［1］、医药^［2］、保健品^［3-4］、食品加工^［5］等方面，核苷酸都有非常广阔的前景。因此核苷酸也引起了许多国家的重视。核酸酶是一种含锌的金属酶，可以高效降解所有形式的dna和rna,被广泛的运用于核苷酸工业生产中，是一种具有重要应用价值的酶制剂。核酸酶 p₁（e.c.3.1.30.1）由桔青霉产生的一种能将单链 dna 和 rna 水解为 5′-核苷酸的磷酸二酯酶。酶是一种对反应环境十分敏感的生物催化剂，过酸、过碱或高温都可能使其失去生物活性。为了更好的实现酶的催化性能，各国的研究人员都为寻找到更为合适的固定化载体而不断努力。定向固定化是一种新型固定化方法，可以实现对酶蛋白空间沉积方向的控制，具有酶活回收率高等优点，是一种有效的固定化方法。

传统的固定化一般认为是通过酶分子上的氨基酸残基随机固定在载体上，这样会导致酶多个位点和载体结合，破坏酶天然构象或者出现位阻障碍而妨碍底物进入到酶的活性位点，最终使固定化酶活性大幅度下降。据文献固定化酶常用载体-氨基树脂，具有机械强度高，稳定性好，载酶量大^［6］，易于分离，可重复使用。氨基树脂具有大量酶可利用的孔，在固定化过程中核酸酶p1主要利用的孔径为4～30nm。相对游离的核酸酶p₁而言，所得固定酶耐热、耐热性增强；米氏动力学研究表明固定酶对底物的亲和力下降，最大反应速率下降；在定向固定化被研究之前，研究的重点放在如何完善固定化方法来提高酶回收率。就如rokugawa^［7］等以离子作用先将纯化的核酸p₁固定在钛化纤维素上，酶活回收率为83%,随后又分别用钛化离子交换树脂和钛化无机载体（包括大孔硅胶珠、大空玻璃珠和浮石等）为载体固定化核酸酶p_1，其酶活回收率均大于50%。同时设计固定床柱反应器水解1%的rna，底物完全水解且可连续运行24d以上。shi^［8］等以共价和交联法先后将核酸酶p₁粗酶固定在纤维素及壳聚糖微球上，其酶活回收率均大于50%。li^［9］等利用大孔吸附树脂交联核酸酶p₁，明显提高了酶的热稳定性，但还是难以实现工业化。he^［10］等通过优化氨基树脂固定核酸酶p₁的固定条件，将酶和载体比例调为3:20(质量比)，酶浓度调为0.8 g.l^-1,酶液ph调为6.0，固定时间改为10h，所得的固定酶的单位酶活为10013 u.g^-1 。相比较而言酶定向固定^［11］是一种新型的固定化方法，由于固定后可完全暴露其活性部位，因而可以保持比较高的酶活回收率。目前发展的定向固定化方法主要有：非共价定向固定，主要是抗体与抗原之间的特殊亲和性，酶表面的的抗原区域能和其特定抗体通过这种特殊亲和作用紧密地连接。将先在载体上固定抗体，通过抗体定向固定化酶^［12］；亲和素/链霉亲和素与生物素之间的高度专一的亲和作用；多聚组氨酸标签与金属螯合物之间的亲和作用^［13］；共价定向固定，主要通过半胱氨酸残基上的巯基与载体直接或间接作用^［14］。li^［15］利用分子生物学的方法对漆酶进行定点生物修饰，借助于半胱氨酸的侧链巯基和金基底形成的硫-金键常用来构建自组装修饰电极。在漆酶的氮端或碳端引入半胱氨酸来定向固定漆酶，对于漆酶底物催化和直接电化学研究具有重大意义。相比较而言，生物素-亲和素系统（bas）具有显著的特点：1、高度特异性，bas的结合反应因为亲和力极高而高度专一，生物素、亲和素结合了就很难分离，这种高度特异、稳定的结合，使得反应试剂经得起高度稀释；2、高度灵敏性；3、简易、快速、安全、稳定。 查得文献，hou^［16］等进行了对生物素-亲和素系统定向固定糖化酶的研究，亲和素是一种糖蛋白，分子质量60ku，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。亲和素分子与生物素分子结合常数（ka）高达1015 mol/l。通过正交试验确定了生物素标记糖化酶的最佳条件：质量浓度为4mg/ml的酶液2ml，反应温度20℃，反应ph4.6，搅拌时间2.5h；其次确定了亲和素-磁性琼脂糖微粒的最佳制备条件是;亲和素30ug/mg,载体，反应时间20min，ph6.6；最后确定了生物素-亲和素系统定向固定糖化酶的最佳条件：生物素标记糖化酶液40ul/mg载体，反应时间20min，反应温度20℃，ph 6.1。此条件下固定化酶活力1629.7u/g，活力回收率50.3%，固定化酶的相对活力64.7%。对固定化酶的酶学性质研究表明，固定化酶的最适作用温度65℃，最适ph 5.1,米式常数k_m为2.28mg/ml,较游离糖化酶的米氏常数小，与底物的亲和力提高。固定化酶连续使用5次，酶活力保持71.8%。同样的方法，zhou^［17］等利用戊二醛将cona和壳聚糖载体交联在一起，然后脲酶的糖基部分和cona连接起来，实现了脲酶的定向固定化，在实验中，首先是优化了固定化条件，分别测得了游离酶和非定向固定化脲酶的酶活力，对定向固定化酶的酶学参数作了深入的研究，分析了影响固定化酶的各种条件。由此，在我看来采用生物素-亲和素系统来固定核酸酶p₁最为合适。在选择了合适的载体，选用cona作为生物素，定向固定化核酸酶p_1，利用奈氏试剂显色法测试核酸酶p₁的酶活,通过比较不同定向固定化条件下核酸酶p₁的酶活，选择最佳的定向固定化条件，更好得实现工业化生产。

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

研究的问题: 1、采用什么载体能更好得固定核酸酶P1； 2、采用何种定向固定化方法； 3、为保证高酶活，连续使用性，定向固定化的最适条件；

研究途径：选择合适的载体，选择ConA作为生物素，利用生物素与亲和素之间的特殊亲和作用定向固定化核酸酶P1，利用奈氏试剂显色法测试核酸酶P1的酶活，通过比较不同定向固定化条件下核酸酶P1的酶活，优化定向固定化条件，更好得实现工业生产化。