论文总字数：24102字

摘 要

利多卡因是一种局部麻醉药且可用于治疗室性心动过速和眩晕症，为可卡因的一种衍生物^[1]。由于目前利多卡因的合成多采用化学法，存在反应条件剧烈、有机溶剂污染等缺陷，而生物法具有突出的环境友好性，反应温和，区域选择性和立体选择性高等优势，但目前还未有生物法合成利多卡因的相关报道。本论文旨在筛选出能够高效催化合成利多卡因的菌株，同时通过基因工程手段找到能够产生催化反应的目标酶，为利多卡因生物合成提供支撑。

通过查阅文献，我们发现部分脂肪酶和蛋白酶可以催化类似的转酰胺合成反应。本研究在许多试验菌株中筛选出一种能够满足生物法合成利多卡因的目标蛋白，命名为SPL。数据库的比对找到目的蛋白的序列，基因合成并导入大肠杆菌进行异源诱导表达，冻干破碎酶液制得酶粉作为催化剂参与合成实验研究。

关键词：利多卡因 蛋白酶 脂肪酶 合成体系 酯氨解反应

Screening of lidocaine synthase

ABSTRACT

Lidocaine is a local anesthetic and can be used to treat ventricular tachycardia. It is a derivative of cocaine. Currently, the synthesis of lidocaine mostly uses chemical methods, which have the disadvantages of severe reaction conditions and organic solvent pollution. The biological method has the advantages of outstanding environmental friendliness, mild reaction, high regional selectivity and stereoselectivity, but it has not yet been There are reports about the synthesis of lidocaine by biological methods. This paper aims to screen out strains that can efficiently catalyze the synthesis of lidocaine, and at the same time find the target enzymes that can produce catalytic reactions through genetic engineering methods to provide support for lidocaine biosynthesis.

By reviewing the literature, we found that some lipases and proteases can catalyze similar transamide synthesis reactions. In this study, a target protein that could meet the biosynthesis of lidocaine was selected from many test strains and named SPL. The database was compared to find the sequence of the target protein, and the gene was synthesized and introduced into E. coli for heterologous induction and expression. The enzyme powder prepared by freeze-drying and breaking the enzyme liquid was used as a catalyst to participate in the synthesis experiment.

KETWORDS: Lidocaine; Protease; Lipase; Synthetic system; Ester aminolysis

目 录

摘 要 I

ABSTRACT i

第一章 文献综述 1

1.1 利多卡因药物合成 1

1.1.1化学法合成利多卡因 1

1.1.2生物催化法在药物合成中的应用 2

1.2 脂肪酶概述 3

1.2.1 脂肪酶的简介 3

1.2.2 脂肪酶的结构特点 3

1.2.3脂肪酶催化酯氨解反应 4

1.3蛋白酶的概述 5

1.3.1蛋白酶的简介 5

1.3.2 蛋白酶的结构特点 5

1.3.3 蛋白酶在有机溶剂中反应 5

1.4 SPL(鞘氨醇单胞菌脂肪酶)的生物功能 6

1.5 研究目的及主要内容 7

第二章 实验材料与方法 8

2.1 材料与仪器 8

2.1.1 菌株 8

2.1.2 实验试剂 9

2.1.3 主要设备 9

2.1.4 培养基 10

2.2 生物法合成利多卡因的探索 12

2.3 研究方法与现象 13

2.3.1 蛋白酶的筛选 13

2.3.2脂肪酶的筛选 15

2.4 SPL的全基因合成 21

2.5 SPL发酵与诱导表达 21

2.6 酶促反应 22

2.7 催化条件的优化 23

第三章 结果与讨论 24

3.1 HPLC检测结果 24

3.1.1利多卡因和2，6-二甲基苯胺的HPLC检测体系建立 24

3.1.2 蛋白酶生产菌筛选结果 25

3.1.3 脂肪酶生产菌筛选结果 26

第四章 结论与展望 29

4.1 结论 29

4.2 展望 29

参考文献 30

致 谢 33

第一章 文献综述

1.1 利多卡因药物合成

利多卡因（Lidocaine）是一种局部麻醉药且可用于治疗室性心动过速，为可卡因的一种衍生物^[1]，分子式为C₁₄H₂₂N₂O,分子量：234.337密度：1.026g/cm³，熔点：350.8℃at760mmHg，闪点：166℃，稳定性：稳定且与强氧化剂不容，包装等级：III，危险类别：6.1，利多卡因盐酸盐为白色结晶性粉末，易溶于水，药性和普鲁卡因相当，但局部麻醉效果较强而持久，有良好的表面穿透力，可注射也可作表面麻醉，一般施用一到三分钟后即生效，效果维持一到三小时^[2]。兴奋和抑制作用会出现在利多卡因在注射后，同样的，镇痛、嗜睡等症状会伴随出现。本品在低剂量时，可促进心肌细胞内K 外流，降低心肌的自律性，而具有抗室性心率失常作用；在治疗剂量时，对心肌细胞的电活动、房室传导和心肌的收缩无明显影响；血药浓度进一步升高，可引起心脏传导速度减慢，房室传导阻滞，抑制心肌收缩力和使心排血量下降^[3]。

1.1.1化学法合成利多卡因

利多卡因是一种有效的局部麻醉和抗心律失常药物，长期以来国内外均采用两种方法合成，第一种为2,6-二甲基苯胺与氯乙酰氯作用，再与二乙胺缩合的方法制得^[4]，反应过程中使用丙酮为溶剂、碳酸盐为催化剂。第二种为二乙氨基乙酸甲酯法，在甲醇钠存在下，2,6-二甲基苯胺与N,N-二乙基乙酸甲酯缩合，然后酸化成盐得到产品^[4]。但是以氯化亚砜与一氯醋酸作用合成氯乙酰氯时放出大量的二氧化硫和氯化氢气体，污染环境的同时还会损害操作人员健康^[5]，如图一所示。其次化学法的合成产量也并不理想，因此我们试图探索生物酶法合成利多卡因的催化路径，生物酶法的合成有其突出的环境友好型的特点，同时基于微生物培养技术的不断发展，也提供了合成途径更多的可操作性。通过大量文献查阅相关酶法合成酰胺化反应的成功案例以及从野生菌菌库当中进行一定数量的筛选工作以期获得目标菌株或蛋白。

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