论文总字数：20668字

摘 要

头屑是头皮疾病的一种，医学上称其为“头皮糠疹”，有着相对较高的发病率。在患病人群中，头皮上以及头发上会有许多微小白色的油腻碎屑，同时伴随着瘙痒、刺痛、灼烧感等感觉。尽管头屑在人群中较为常见，但是仍尚未完全清楚其成因与发病机制。目前多数研究表明，微生物在头屑的发病过程中起到了重要作用。本次研究的目的就是建立一个包含我国100余人的头皮微生物数据库，通过该数据库，获得我国不同地域、年龄、性别等环境下人体头皮微生物的特点，根据头屑数量的不同的人群，来区分有益微生物与有害微生物，以及应该怎样利用相关的微生物或产品治疗头皮疾病。经研究发现头皮屑人群的微生物多样性要高于健康人群，但是其均匀度要低于健康人群。其中细菌的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)以及真菌的马拉色氏菌(Malassezia)在头皮屑人群与健康人群中均未在多样性分析中显示出显著差异。

关键词:头皮屑 群落微生物 马拉色氏菌 ITS 16SrDNA

Monitoring of dandruff microbial community

Abstract

Dandruff is a skin disorder of the scalp, it’s call capitis pityriasis in medicine, it’s have a high incidence of disease. In the diseased population, there will be many small white greasy debris on the scalp or hair, accompanied by itching, tingling, burning and other feelings. Although dandruff is widespread in the population, the pathogenesis of dandruff are still unclear. At present, most studies show that microorganisms is significant in the pathogenesis of dandruff. The purpose of this study is to establish a scalp microbiological database containing more than 100 people in China. Through this database, we can get the characteristics of scalp microbiological in different regions, ages, genders and other environments in China. According to the different population of dandruff numbers, we can distinguish the beneficial and harmful microorganisms, and how to use the relevant microorganisms or products to treat scalp diseases Illness. It is found that the diversity of microorganisms in dandruff population is higher than that in healthy population, but its evenness is lower than that in healthy population. Among them, Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes and Malassezia did not show significant difference in diversity analysis between dandruff population and healthy population.

Key words: Dandruff; Microbial communities; region; ITS; 16SrDNA

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 前言 1

1.1 头皮屑 1

1.2 皮肤屏障 1

1.3 头皮微生物 3

1.3.1 头皮真菌组成 3

1.3.2 头皮细菌组成 5

第二章 实验材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 材料 7

2.1.2 试剂 7

2.1.3 试剂盒 8

2.1.4 主要仪器 8

2.2 实验流程 8

2.2.1 采样对象的选择 8

2.2.2 采样过程 9

2.2.3 微生物基因组DNA的提取 9

2.2.4 琼脂糖电泳 11

2.2.5 文库构建和测序 11

2.2.6 序列处理及分析 11

第三章 结果 12

3.1 物种注释信息 12

3.2 稀释曲线 14

3.3 微生物群落多样性分析 16

3.3.1 细菌α多样性分析 16

3.3.2 真菌α多样性分析 17

3.3.3 细菌β多样性分析 19

3.3.4 真菌β多样性分析 21

3.3.5 细菌LAD值分布柱状图及进化分支图 23

3.3.6 真菌LAD值分布柱状图及进化分支图 25

3.3.7 头皮马拉色菌属 27

第四章 讨论 28

第五章 总结与展望 30

参考文献 31

致谢 33

第一章 前言

1.1 头皮屑

头皮屑是一种十分常见的疾病，据不完全统计，全球超过一半的人口在某个阶段会出现头皮屑，通常是在青春期后，多发于长有终毛的头皮。头皮屑是头皮的角质细胞脱落而成，通常情况下这些脱落的部分是肉眼不可见的，可是在头皮屑患者人群中则表现为大量产生聚集脱落，形成纷纷扬扬许多白色小碎片落下^[1]。头皮屑脱落的症状也会在患有一些皮肤病的人群身上出现出现，如牛皮藓、头藓和脂溢性皮炎患者等。目前的研究还无法完全解释头屑的发病机制，但是其中许多研究表明，头皮屑的产生于微生物有一定程度的关联。目前学术界认为影响头皮屑发病最关键的三个要素是马拉色氏菌(Malasseziasp.)的定殖、皮脂的含量以及个体易感性。头皮屑发生的时间和形式是由这三个原因的共同决定的。随着青春期的到来，人们头皮的皮脂腺发育完成，分泌较多皮脂，为马拉色菌提供以脂肪为营养来源的生长条件，最后引起了头皮屑的产生。

1.2 皮肤屏障

皮肤作为人体的重要组成部分，防止了外来危害的入侵，也同时维持着人体热量和水分等，防止它们的流失，起着十分重要的屏障功能。皮肤屏障大致可分为物理屏障、化学屏障和适应性免疫屏障三种^[2]。其中物理屏障主要位于角质层，如果角质层出现鳞屑，那么便是头皮屑产生的典型症状。角质层是防止有毒物质、氧化剂、微生物以及紫外线等致病因子进入人体的保障。它最普遍的功能就是保留人体内的水分，这被称为表皮渗透屏障(epidermal permeability barrier, EPB)^[3]。角质形成细胞分化的最后阶段角蛋白通过与丝聚蛋白相互作用形成高度有序排列和凝聚的紧束状，促使细胞坍陷形成扁平状的角化细胞，通过角化桥粒连接，同时，角化细胞的细胞膜发生大范围的交联，以此来形成角质化包膜^[4]。颗粒层的板层小体和棘细胞层以上的细胞向质膜移动的过程中，通过胞吐释放脂质，以修饰和排列的方法将其整合到角质形成细胞中，并平行于细胞表面，组成结构脂质的成分有神经酰胺(50%)、胆固醇(25%)和脂肪酸(10%~20%)^[5]。同时，一些水平较低的脂类也许也起着一定程度的作用。因为身体不同部位的皮肤有所差异，因此不同位置的角质层中脂质的成分、角化细胞的大小与形状、角质层厚度以及角化桥粒的数量等因素都可能有所不同。化学屏障由脂质、水解酶、酸、巨噬细胞和抗菌肽组成^[6]。皮脂腺分泌和角质层上皮细胞的崩解过程产生的游离性脂质主要覆盖于皮肤的表面,与汗腺上皮细胞分泌的角质细胞水分和透表皮蒸发的水分乳化形成皮脂膜^[7]。皮脂膜内的游离性脂质为一种游离性的脂质,主要成分是角甘油三酯、三十碳六烯、蜡酯和其他游离性的脂肪酸,还可能含有许多其他代谢产物或其他水溶性分子,被称为天然保湿因子(natural moisturising factor, NMF),它是保证水含量在角质层中平衡的关键成分之一^[8]。想要保持皮肤的角质层完整脱屑需要许多的角化桥粒细胞来确保。角化桥粒可以把许多接近的角化细胞牢牢结合住,也将相连的角质层牢牢连接起来。为了保证角质层的完整性以及控制角质层的稳定性和厚度，脱屑的过程是必不可少的。健康人群的身体通常通过对角化桥粒的调整来进行脱屑，它们可以依靠自身调节生产一些水解酶来控制角化桥粒的降解。^[9]。这些水解酶实际上是由角质层的含水量和pH值在调节。因此表皮的含水量是十分关键的的。在头皮屑患者身上，不正确的角化桥粒水解可能是其头皮屑产生的一大原因。组成适应性免疫屏障的重要部分是T细胞和抗原提呈细胞，表皮中的朗格汉斯细胞具有抗原提呈功能，它在皮肤损伤或病原微生物入侵时就会被激活，离开表皮来到到局部引流淋巴结，同时不断成熟增强其抗原提呈能力，与T淋巴细胞结合之后进行与外来抗原的免疫应答^[10]。

对于患有头皮屑的人群，其头皮的角质层中的结构脂质含量下降了许多，其中的各种脂质间比例也有所变化，伴有组织结构损伤。另外，有研究显示，头皮水屏障是由角质层中的游离脂肪酸、胆固醇、神经酰胺来维持的，当这些成分减少时，头皮水屏障就会收到损害^[11]，角质层水合作用能力会因此受到削弱，导致其体积与面积缩小，破碎后形成鳞屑^[12]。同时水屏障被破坏又会使微生物的定殖情况进一步恶化，由此形成不良循环难以恢复。

1.3 头皮微生物

微生物广泛存在于人体的皮肤之上，包含细菌、真菌、古生菌等，它们一起构成了人体表皮的微生物群系，科学上通常根据它们与宿主的关系而将它们分为共生菌与病原菌，既与宿主和平共处甚至是互利互惠的菌以及引起宿主皮肤感染的菌。人体的微生物组成十分复杂，不同位置的微生物群落差异巨大。人体头皮上的微生物细胞密度大约在10^3~10^5 CFU/mm^[13]，其中的菌群主要包括马拉色氏菌属（Malassezia sp.）、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)和丙酸杆菌属(Propionibacterium sp.)^[14]。

1.3.1 头皮真菌组成

如今，很多研究都认为对头皮屑的产生的起到关键作用的真菌是马拉色菌(Malassezia)，而使用部分抗真菌的药物能明显直接减少头皮屑的生成。马拉色菌是存在于人体与动物的皮肤表面的常见真菌，其能够导致机会性感染，从而引发相关疾病。Malassez于1874年首次发现了这种菌，在当时将其命名为糠疹癣菌(Pityrosporum)。在1990年时，其被重新定义为马拉色氏菌属。在Soares 等进行的头皮屑微生物组研究中，实验样本为24位巴西人，一共得到了274个真菌 OTU,在获得的真菌序列之中有大于96%的序列被注释为马拉色氏菌属，在种的水平共发现了9个种的属于马拉色氏菌属的微生物，包括糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)、球形马拉色菌(Malassezia globosa)、合轴马拉色菌 (Malassezia sympodialis)、斯洛菲马拉色菌(Malassezia slooffiae)、限制性马拉色菌(Malassezia restricta)、钝形马拉色菌(Malassezia obtusa)、厚皮马拉色菌(Malassezia pachydermatis)、皮肤马拉色菌(Malassezia dermatis)、日本马拉色菌(Malassezia japonica)，除此之外，研究者还发现了大量被标注为马拉色氏菌属的未知物种存在(＞37%)存在于头皮上^[15]。研究显示，健康人群的真菌多样性要低于头皮屑人群，并且头皮屑人群的头皮微生物群落组成在样本之间有着较大的不同。健康人群头皮上的曲霉真菌属(Aspergillus)、真菌念珠菌属(Candida)和Filobasidium属丰度要小于头皮屑人群，但是在两者之间马拉色氏菌属的含量无明显差异^[15]。在马拉色菌属之中，出现于人类头皮上的优势种为球形马拉色菌与限制性马拉色菌，它们生长在头皮的毛囊之中的可能性很大，如毗硫翁锌这样的抗真菌药物能有效果可能就是因为它能有效的渗透到毛囊的漏斗部。研究显示定殖于头皮屑人群头皮上的马拉色氏菌的数目是健康人群的1.5~2.0倍^[16]，且在头皮屑人群中，限制性马拉色菌丰度较高，而在健康人群中，球形马拉色菌丰度较高，研究还表明了限制性马拉色菌和其他菌种之间的相互作用关系比其是否存在更容易影响到头皮屑的产生^[17]。尽管如此，因为目前相关数据库容量的还不够充足，且序列比对方法也比较少，目前头皮上仍然有大量的真菌无法被注释出来，且头皮屑人群之间也有着一定程度的个体差异，因此现在的研究仍然不能明确马拉色菌在头皮屑患者的头皮屑产生的中是处于何种地位。对此前人的文献中提出了一些假说，下面将对其中三种进行阐述。

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