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摘 要

作为自然界储量最丰富的可再生资源，纤维素因其高效的生物转化，对实现人类社会的可持续发展具有重要意义。但是纤维素的完全降解需要多种酶的协同作用，即使具有反应条件温和、效率高和污染少等许多优点，但酶种类多、用量过大导致的酶成本过高等问题仍然阻碍了纤维素转化技术商业化的进展。近年研究者发现的持续性内切纤维素酶同时具有内切酶和外切酶的催化特性，为纤维素的协同降解提供了新的途径。此外对持续性内切酶催化中心的氨基酸残基的定点突变，使持续性酶的催化性能显著提高。突变体的酶学性质往往也会随之改变，酶学性质的影响也会体现在酶的实际应用中。因此本文对持续性内切酶D70Q/S235W突变体的酶学性质和水解产物进行研究。结果表明，D70Q/S235W在最适温度和最适pH条件下的稳定性相比于野生型有所提高；组合突变体D70Q/S235W对于不同底物CMC、Avicel以及PASC水解产物依然以纤维二糖和纤维三糖为主。

关键词：持续性内切酶；酶学性质；水解产物；突变体

Study on enzymological properties and hydrolysates of mutant D70Q / S235W

Abstract

As the most abundant renewable resources in nature, cellulose is of great significance to the sustainable development of human society because of its efficient biotransformation. However, the complete degradation of cellulose requires the cooperation of many enzymes. Even with the advantages of mild reaction conditions, high efficiency and less pollution, the problems of too many kinds of enzymes and too high enzyme cost caused by too much dosage still hinder the commercialization of cellulose conversion technology. In recent years, researchers found that continuous endocellulase has the catalytic properties of both endoenzyme and exoenzyme, which provides a new way for the collaborative degradation of cellulose. In addition, site directed mutation of amino acid residues in the catalytic center of persistent endonuclease significantly improved the catalytic performance of persistent endonuclease. The enzymatic properties of mutants often change with them, and the influence of enzymatic properties will also be reflected in the practical application of enzymes. Therefore, the enzymatic properties and hydrolysates of mutant D70Q/S235W were studied. The results showed that the stability of D70Q/S235W at the optimum temperature and pH was higher than that of wild type, and the hydrolysates of D70Q/S235W were mainly cellobiose and cellobiose for different substrates CMC, Avicel and PASC.

KEYWORDS: Processive endonuclease；Enzymological properties；Hydrolysates；Mutant

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 纤维素 1

1.1.1 纤维素的来源 1

1.1.2 纤维素的化学结构 1

1.1.3 纤维素的应用 1

1.2 纤维素酶的概述 1

1.2.1 内切葡聚糖酶 1

1.2.2 外切葡聚糖酶 2

1.2.3 β-葡萄糖苷酶 2

1.2.4 纤维素酶的协同作用 2

1.3 持续性内切酶的研究进展 2

1.3.1 纤维素酶持续性作用的研究进展 2

1.3.2 持续性内切纤维素酶的研究进展 4

1.4 纤维素酶的应用 5

1.4.1 食品工业应用 5

1.4.2 畜牧生产应用 6

1.4.3 发酵工业应用 6

1.4.4 环境保护应用 6

1.5 课题研究意义 7

第二章 材料和方法 8

2.1 实验材料与仪器 8

2.1.1 菌株和培养基 8

2.1.2 实验相关溶液的配制 8

2.1.3 实验试剂 11

2.1.4 实验仪器 11

2.2 实验方法 11

2.2.1 再生无定形纤维素（PASC）的制备 11

2.2.2 原始酶EG5C-1和突变体酶的表达与纯化 12

2.2.3 SDS-PAGE蛋白电泳 12

2.2.4 目的蛋白的纯化 14

2.2.5 蛋白浓度的测定 15

2.2.6 葡萄糖标准曲线的绘制 17

2.2.7 纤维素酶活力的测定 17

2.2.8 原始酶EG5C-1与突变体的酶学性质测定 18

2.2.9 原始酶EG5C-1与D70Q/S235W的水解产物分析 18

第三章 结果与讨论 20

3.1 原始酶EG5C-1与D70Q/S235W的酶学性质 20

3.1.1 原始酶EG5C-1与突变体的最适温度和温度稳定性 20

3.1.2 原始酶EG5C-1与突变体的最适pH和pH稳定性 21

3.2 原始酶EG5C-1与D70Q/S235W的水解产物分析 22

第四章 结论与展望 24

4.1 结论 24

4.2 展望 24

参考文献 25

附 录A 实验试剂 30

附 录B 实验仪器 32

致谢 34

文献综述

纤维素

纤维素的来源

地球上的植物经过光合作用合成纤维素，是分布最广且最丰富的多糖类物质，也是地球上永不枯竭的可再生资源。此外，纤维素还是植物结构细胞壁的重要组成成分之一，就连海洋无脊椎动物被囊类和人的结缔组织中都含有许多纤维素^[1]。

纤维素的化学结构

纤维素大分子的基环是脱水葡萄糖，分子式为(C₆H₁₀O₅) n，多个β-D-葡萄糖残基彼此由β-1,4糖苷键连接，形成以椅式构象联结的线性葡聚糖^[2]。纤维素又可分为结晶相和非结晶相，其中结晶相存在巨大的氢键网络，是由大量的羟基基团形成的氢键组成的^[2]。这个氢键网络可以加强晶体结构的稳定性，因此纤维素与化学试剂的作用难以进行^[3]，从而导致纤维素酶的用量巨大。

纤维素的应用

纸和纺织品主要来自天然纤维素。改型纤维素有其他用途，比如乙基纤维素是一种热塑塑料和粘合剂，醋酸纤维素是最重要的纤维素酯，可用于制造各种薄膜，生化实验中常用醋酸纤维素薄膜，羧甲基纤维素和微晶纤维素在食品工业中分别用作粘稠剂和填充剂^[1]。

纤维素酶的概述

内切葡聚糖酶

内切葡聚糖酶（endo-1,4-β-D-glucanohydrolase，EG）是作用于纤维素的非结晶区域的并随意地切割β-1,4糖苷键并形成新的糖链末端和聚合度不同的纤维寡糖产物，水解产物为纤维糊精、纤维三糖以及纤维二糖等^[4]。EG来源广泛，且大多数微生物可以同时表达一种或多种内切葡聚糖酶。内切葡聚糖酶的表观分子质量大多在23 kDa-146 kDa，最适温度在50-70 ℃左右，且大多属于偏酸性的纤维素酶。其空间构象如同凹槽（groove），活性中心位于结构开放的凹槽之中^[5]。显然，凹槽有利于纤维素链内部的某一位点直接进入然后将其切断。

外切葡聚糖酶

外切葡聚糖酶（exo-β-1,4-glucanase，CBH）以纤维素多糖链的还原性或非还原性末端为作用位点进行催化降解，其主要产物为纤维二糖和纤维糊精^[6]。CBH的分子量一般在50 kDa-113 kDa之间，最适pH在酸性范围内，最适温度在37-60 ℃左右。其空间构象与内切葡聚糖酶不同，呈现一条封闭的通道结构^[7]，这样的通道仅允许单链纤维素逐个通过。

β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，BG）作用于可溶性的纤维二糖和纤维寡糖水解并产生葡萄糖等单糖产物^[8]。同时作为降解过程中的关键酶，可以解除纤维二糖产物对外切葡聚糖酶抑制作用，使整个降解过程持续进行^[9]。β-葡萄糖苷酶来源广泛，主要分布在糖基水解酶1和3家族，且来源不同的酶的分子量和酶学性质如最适pH和最适温度都有较大的差异。

纤维素酶的协同作用

天然纤维素的结构和组织十分复杂和坚固，通常需要微生物分泌一系列的酶才能将纤维素高效的降解为可利用的糖类^[10]。目前，大多数研究者认为Lynd和Zhang等^[11]提出的纤维素酶协同降解理论认为，三种酶分别作用于不同的位点并产生不同的底物，三类酶的协同作用对纤维素的降解效果大于任何单一组分的降解作用，协同作用也从多种纤维素降解菌产生的酶系中得到证实。

持续性内切酶的研究进展

纤维素酶持续性作用的研究进展

持续性是指具有持续性的酶与反应底物结合后进行单方向的移动，并在酶与底物解离前可以完成多轮催化反应的功能^[12]。而具有持续性降解特性的纤维素酶包括外切葡聚糖酶和持续性内切葡聚糖酶。

1. 外切葡聚糖苷酶持续性水解作用

目前研究者对不同来源外切酶的持续性过程及限速步骤开展了大量的研究。其中来源于T. reesei的Cel7A是研究最多的外切酶。该酶能够作用于纤维素链的还原端并持续性的对纤维素进行降解^[13]。Igarashi等^[14]通过高速原子力显微镜（AFM）对单个纤维素酶进行结晶纤维素降解的过程实现了可视化，并由此推断出了外切纤维素酶持续性降解作用的主要流程（图1）：（1）酶与底物的识别并结合：酶蛋白Cel7A首先与底物结合并作用于纤维素链的还原端，（2）单向滑动：纤维素链的还原端进入酶的催化通道形成酶-底物复合物，（3）底物的水解：酶与底物反应并产生纤维二糖产物，（4）产物的释放：纤维二糖从催化通道脱离，（5）持续性水解：产物释放后，酶仍然与底物结合并再次进行催化降解直至纤维素链完全水解。

图 1外切纤维素酶Cel7A的持续性降解过程

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