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摘 要

亚精胺是一种普遍存在于各种生物体，包括动物（例如鼠、猪、羊、牛等）和植物（如豆类、海带、蘑菇包括海藻以及海洋浮游生物等）细胞中的芳香族多胺，经研究发现其在抗衰老领域有着巨大潜力，目前已应用于保健品中。目前市场上制备亚精胺的主要方法是化学制备法和提取法，但是这两种都有各自的缺陷，不适用于大规模生产。生物合成亚精胺理论上可行，且绿色高效无污染，所以打通亚精胺生物化合成路径和进一步优化提高产量，对工业化大规模生产亚精胺具有重大意义。

本论文利用分子生物学的手段构建了重组菌株BL21(DE3)-pETDuet-speE和BL21(DE3)-pET28a-speD。经过菌株培养、粗酶液制备、催化反应等一系列步骤后得到了目标产品亚精胺。进一步研究得到亚精胺产量最高时限速酶的诱导温度、诱导OD、诱导时间和IPTG添加量，从而使亚精胺的产量达到最高。

关键词：亚精胺 丹磺酰氯 丁二胺 生物合成法

Biosynthesis and enzyme production optimization of Spermidine

ABSTRACT

The essence of amine is a kind of widely exists in various organisms, including animal (e.g., mice, pigs, sheep, cattle, etc.) and plant (such as beans, kelp, mushroom, including algae and Marine plankton) cells of aromatic amine, the study found that in the field has a great potential in anti-aging, has been used in the health care products.At present, the main methods of preparing Spermidine on the market are chemical preparation method and extraction method, but these two methods have their own defects and are not suitable for mass production.Biosynthesis of Spermidine is feasible in theory, and green, efficient and pollution-free. Therefore, it is of great significance to open up the biological synthesis path of Spermidine and further optimize and increase the yield for the large-scale industrial production of Spermidine.

In this paper by using the method of molecular biology, respectively constructed recombinant strain BL21 (DE3) - pETDuet - speE and BL21 (DE3) - pET28a - speD.After a series of steps such as strain culture, preparation of crude enzyme solution and catalytic reaction, the target product spermidine was obtained.Furthermore, the induced temperature, induced OD, induced time and IPTG addition of the rate-limiting enzyme at the time of maximum spermidine production were further studied, so as to maximize the spermidine production

Key words: Spermidine ;Dansyl chlorid ;Butanediamine ;Biogenetic synthesis

目录

第一章 论文综述 1

1.1 天然产物的应用 1

1.2 亚精胺简介 1

1.2.1 亚精胺的应用 1

1.2.2 亚精胺的制备方法 2

1.3 生物合成法 3

1.3.1 生物合成法简介 3

1.3.2 生物合成法的应用举例 3

1.3.3 生物合成法的优势 4

1.4 小结 4

第二章 实验材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.1.1 实验所用的菌株 5

2.1.2 实验所用器材 5

2.2 实验方法 6

2.2.1 质粒构建 6

2.2.2 粗酶液制备 7

2.2.3 催化步骤 8

2.2.4 多胺类物质衍生化 8

第三章 实验结果 10

3.1 生物合成亚精胺的途径 10

3.2 酶的表达验证 10

3.3 检测方法的建立 13

3.4 生物催化丁二胺合成亚精胺体系的建立 14

3.5 SAM脱羧酶优化提高亚精胺合成的研究 15

第四章 结果与展望 19

参考文献 20

致谢 23

论文综述

天然产物的应用

研究发现目前市场使用的药品大半来源于天然产物，例如统计从1981年到2018年这几十年中发行于市场的一千多种药物中，将近四分之三是直接来自天然产物，几乎涉及了治疗疾病的所有方面^[1]。例如在防治恶性肿瘤和传染类病领域中，分别有60%和75%左右的药物来源于天然产物。除去日常见到的药物外，天然产物化学还涉及到工业领域和农业领域，这两个领域与国家的经济发展切实相关^[2]。

亚精胺简介

亚精胺的应用

亚精胺是一种普遍存在于各种生物体，包括动物（例如鼠、猪、羊、牛等）和植物（包括海藻以及海洋浮游生物等）细胞中的芳香族多胺，生物合成亚精胺的底物一般是丁二胺和腺苷甲硫氨酸^[3]。亚精胺具有促进心血管保护、蛋白质与RNA的合成、抗氧化、抗炎、增强蛋白质表达、诱导细胞自噬、调节神经、改善线粒体代谢、提高RNA聚合酶活性，延缓衰老、提高记忆力等多种功能^[4]。

众所周知，包括人类、果蝇、小鼠在内的多种生物，随着年龄的增加都有不同程度的记忆丢失情况，这种情况与生物体内多胺（尤其是腐胺和亚精胺）的减少有关 ^[5]。有国外期刊报道，外源喂养亚精胺可以显著降低小鼠、果蝇发育中与年龄有关的氧化损伤，推测原因可能是较多含量的亚精胺导致生物体内的自噬功能显著加强，维持了体内各种器官的生理功能；外源添加亚精胺喂养老年果蝇后，其体内的多胺含量居然可以恢复到同比幼虫时期，并且同时修复了其由于年龄增长导致的的记忆丢失；通过亚精胺喂养，同样可以修复样品小鼠由于年龄增长导致的生理危害，并且能延长最高达到40%的生命时长^[6]；这些报道支持了多胺类物质尤其是亚精胺在抗衰老和恢复由于年龄增加导致的相关记忆丢失领域起着重要作用的观点^[7]。

当前国内对于亚精胺的研究也是集中在抵抗衰老，改善代谢性疾病等方面^[8]，研究证明多胺类物质尤其是亚精胺对阿尔茨海默病的预防和治疗方面具有良好的趋势，因此其在保健品和医药领域具有潜在的应用价值^[9]。

亚精胺的制备方法

1. 化学制备方法

图 1-1 亚精胺化学法制备图（1）

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