论文总字数：22616字

摘 要

几丁质在自然界中含量丰富，而其降解产物几丁寡糖及N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc），具有治疗骨关节疾病、抗肿瘤、抗菌及增强免疫等作用，在医疗、美容、保健等领域都有应用。酶法降解几丁质，因其反应条件温和、产物生物活性好且绿色环保，具有巨大的发展前景。

本研究通过基因工程手段将几丁质酶基因CmChi4构建在质粒pET-28a( )上，并转入E.coli BL21(DE3)中表达，该重组酶分子量大小为72.1 kDa。对重组酶CmChi4的酶表达表达条件进行了优化，结果表明诱导OD₆₀₀为0.9，诱导剂IPTG的添加量为0.25 mM，诱导温度为18°C时CmChi4的表达最佳。CmChi4酶学性质研究表明，在温度50°C、pH为6.5时活力最佳；Fe² 、K 、Al³ 和Zn² 对酶CmChi4具有较强的激活。此外，对重组酶CmChi4水解胶体几丁质的产物进行了分析，水解产物为(GlcNAc)₂、(GlcNAc)₃和(GlcNAc)₄。

关键词：几丁质 几丁质酶 N-乙酰氨基葡萄糖

Cloning, expression and application of a chitin endonuclease CmChi4

Abstract

Chitin is rich in nature, and its degradation products chitin oligosaccharide and N-acetylglucosamine (GlcNAc), have the effects of treating bone and joint diseases, anti-tumor, antibacterial and enhancing immunity, and have been used in medical treatment, cosmetology, health care and other fields. Enzymatic degradation of chitin has a great development prospect because of its mild reaction conditions, good biological activity and green environmental protection.

In this study, the chitinase gene CmChi4 was constructed on the plasmid pET-28a ( ) by genetic engineering and expressed in E.coli BL21 (DE3). The molecular weight of the recombinant enzyme was 72.1 kDa. The expression conditions of recombinant enzyme CmChi4 were optimized. The results showed that the expression of CmChi4 was the best when the induction OD₆₀₀ was 0.9 and the amount of inducer IPTG was 0.25 mM, at 18°C. The study on the enzymatic properties of CmChi4 showed that the activity was the best when the temperature was 50°C and pH was 6.5. Fe² , K , Al³ and Zn² had strong activation of CmChi4. In addition, the hydrolyzed products of colloidal chitin by recombinant enzyme CmChi4 were analyzed, and the hydrolyzed products were (GlcNAc)₂, (GlcNAc)₃ and (GlcNAc)₄.

Key Words: Chitin; Chitinase; N-acetyl glucosamine

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 几丁质 1

1.1.1 几丁质概述 1

1.1.2 几丁质的降解 2

1.1.3 几丁质及其降解产物的应用 3

1.2 几丁质酶的概述 4

1.2.1 几丁质酶 4

1.2.2 几丁质酶的分类 4

1.2.3 几丁质酶的应用 5

1.3 本文的研究意义及研究内容 6

1.3.1 研究意义 6

1.3.2 研究内容 6

第二章 实验材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 菌株与质粒 7

2.1.2 实验试剂与酶 7

2.1.3 实验仪器 7

2.1.4 培养基 7

2.2 重组菌株的构建 7

2.2.1 细菌全基因组的提取 7

2.2.2 目的基因的扩增 7

2.2.3 目的基因及质粒酶切连接 8

2.2.4 表达载体的构建 9

2.2.5 重组菌株的构建 9

2.3 重组酶CmChi4的表达及纯化 10

2.3.1 重组酶CmChi4表达条件的优化 10

2.3.2 重组酶CmChi4的纯化 10

2.4 重组酶CmChi4酶学性质的研究 11

2.4.1 重组酶CmChi4酶活的定义 11

2.4.2 温度对重组酶CmChi4的影响 11

2.4.3 pH对重组酶CmChi4的影响 12

2.4.4 金属离子对重组酶CmChi4的影响 12

2.5 重组酶CmChi4水解几丁质的应用 12

2.5.1 检测方法 12

2.5.2 重组酶CmChi4水解几丁质产物的鉴定 12

第三章 结果与讨论 14

3.1 重组菌株的构建 14

3.1.1 目的基因的扩增 14

3.1.2 表达载体的构建 14

3.2 重组菌株CmChi4的表达及纯化 15

3.2.1 重组酶CmChi4的表达条件优化 15

3.2.2 重组酶CmChi4的纯化 17

3.3 重组酶CmChi4酶学性质的研究 18

3.3.1 温度对重组酶CmChi4的影响 18

3.3.2 pH对重组酶CmChi4的影响 19

3.3.3 金属离子对重组酶CmChi4的影响 20

3.4 重组酶CmChi4水解几丁质 21

第四章 结语与展望 22

参考文献 23

致谢 26

附录 27

第一章 文献综述

1.1 几丁质

1.1.1 几丁质概述

几丁质（Chitin）：是一种天然含氮聚糖，它的基本组成单元是N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）通过β-1,4糖苷键连接而成的线性多糖，分子式为(C₈H₁₃O₅N)_n^[1]。几丁质为白色或灰白色无定型固体。

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