论文总字数：25659字

摘 要

自上世纪起，各国研究人员广泛关注产油微生物，因其产出的脂肪酸组分、甘油三酯等油脂可用作生物柴油或功能性营养添加剂的原料。微生物油脂产量稳定可靠，产品质量可控，不受季节、气候等因素影响，可以克服鱼油来源的缺陷，成为功能性油脂的主要来源。因此，目前已用于工业生产二十二碳六烯酸DHA的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)的产油途径受到广泛关注。

NADPH是脂肪酸合成的关键辅因子，转氢酶循环是产油微生物特有的合成NADPH的关键途径。本论文以裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)的转氢酶循环中三种重要的催化酶——丙酮酸羧化酶(PC)、苹果酸脱氢酶(MDH)、苹果酸酶(ME)为研究对象，基于裂殖壶菌的基因组序列，获得了丙酮酸羧化酶(PC)、苹果酸脱氢酶(MDH)、苹果酸酶(ME)三种酶的基因序列；同时，基于已有的生物信息学工具，对三种关键酶进行理化性质和蛋白结构的分析。此外，通过横向分析，将数据库中不同来源的同种酶与裂殖壶菌转氢酶循环中的关键酶进行横向比较，得出一些颇有研究意义的结论。

关键词：裂殖壶菌 丙酮酸羧化酶 苹果酸脱氢酶 苹果酸酶

Abstract

Since the last century, researchers from various countries have paid close attention to oil-producing microorganisms, because the fatty acids and triglycerides produced by them can be used as raw materials for biodiesel or functional nutritional additives. The production of microbial oil is stable and reliable, the product quality is controllable, and it is not affected by factors such as season and climate. It can overcome the defects of fish oil sources and become the main source of functional oils. Therefore, the oil production route of Schizochytrium sp., Which has been used for the industrial production of docosahexaenoic acid DHA, has received widespread attention.

NADPH is a key cofactor for fatty acid synthesis, and the transhydrogenase cycle is a key pathway for the synthesis of NADPH that is unique to oleaginous microorganisms. In this paper, three important catalytic enzymes in the transhydrogenase cycle of Schizochytrium sp.-Pyruvate carboxylase (PC), malate dehydrogenase (MDH), malate enzyme (ME) For the research object, based on the genome sequence of Schizochytrium, the gene sequences of three enzymes of pyruvate carboxylase (PC), malate dehydrogenase (MDH) and malate enzyme (ME) were obtained; meanwhile, based on Some bioinformatics tools analyze the physical and chemical properties and protein structure of three key enzymes. In addition, through horizontal analysis, the same enzymes from different sources in the database were compared horizontally with the key enzymes in the Schizochytrium transhydrogenase cycle, and some significant conclusions were drawn.

Key words：Schizochytrium sp.; Pyruvate Carboxylase; Malate Dehydro-genase; Malate Enzyme

目录

第一章 文献综述及研究背景 1

1.1裂殖壶菌发酵生产DHA背景介绍 1

1.1.1裂殖壶菌简介 1

1.1.2裂殖壶菌合成DHA概述 1

1.1.3发酵合成DHA 代谢机理 2

1.2转氢酶循环中的关键酶 3

1.2.1丙酮酸羧化酶 3

1.2.2苹果酸脱氢酶 3

1.2.3 苹果酸酶 3

1.3 生物信息学方法 4

1.3.1 生物信息学简介 4

1.3.2 生物信息学的主要研究内容 4

1.3.3 本研究涉及的生物信息学手段 5

1.4 主要研究内容 5

第二章 实验材料与方法 7

2.1实验材料 7

2.1.1菌株来源 7

2.1.2氨基酸序列 7

2.1.3实验所用生物信息库，软件和数据库 9

2.2实验方法 9

2.2.1氨基酸序列比对 9

2.2.2二级结构预测 10

2.2.3系统进化树构建 10

2.2.4理化性质分析 10

2.2.5疏水性分析 10

2.2.6信号肽分析 10

第四章 结果与讨论 11

4.1 PC、MDH、ME理化性质分析 11

4.1.1 PC理化性质分析 11

4.1.2 MDH理化性质分析 11

4.1.3 ME理化性质分析 12

4.2 PC、MDH、ME疏水性分析 12

4.3 PC、MDH、ME信号肽分析 13

4.4 PC、MDH、ME氨基酸序列比对 14

4.4.1 PC氨基酸序列比对 14

4.4.2 MDH氨基酸序列比对 14

4.4.2 ME氨基酸序列比对 14

4.5 PC、MDH、ME二级结构预测 14

4.5.1 PC二级结构预测 14

4.5.2 MDH二级结构预测 16

4.5.3 ME二级结构预测 17

4.6 PC、MDH、ME系统进化树的构建 18

4.7 本章小结 20

参考文献 22

第一章 文献综述及研究背景

1.1裂殖壶菌发酵生产DHA背景介绍

DHA，二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)，俗称“脑黄金”，是ω-3多不饱和脂肪酸家族的重要成员，具有多种重要的生理功能，如促进大脑神经细胞生长发育、提高免疫能力、保护视力、降血脂、降血糖以及抗癌等功能，被誉为新一代功能保健因子，受到全球科研人员的极大关注。 能够代谢合成DHA 的微生物主要是有隐甲藻(Crythecodiniumcohnii sp.)、破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)、裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)等低等海洋微藻和真菌。与其它合成DHA的微生物相比较，裂殖壶菌具有生长速度快和培养方式简单的特点，而且其含有大量对人体有益的胞内脂肪酸，目前来看是进行工业化大批量生产DHA的理想物种之一，具有十分广阔的应用空间。

1.1.1裂殖壶菌简介

裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)，是属于真菌门(Eumycota)、卵菌纲(Oomycetes)、水霉目(Saprolegniales)、破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)的一类类藻型海洋真菌，又称裂壶藻，为单细胞，一般呈球形^[1]。裂殖壶菌体内富含油脂、角鲨烯等有利于人体的活性物质，DHA的质量分数在总脂肪酸中所占比例最高可达45%，且细胞中绝大部分的油脂以甘油三酯(TG)的形式存在，极易被人体吸收利用，部分是以卵磷脂(PC)的形式存在，如1-棕榈-2-DHA-PC和1,2-双-DHA-PC等。

1.1.2裂殖壶菌合成DHA概述

自1980s起，人们对PUFA（polyunsaturated fatty acid）如何在体内发挥作用的认识不断深入，如何生物合成DHA引起了科研人员的关注。日本和一些欧美国家工业化发酵生产DHA的研究历史早于我国，技术比较成熟。美国的Omega生物技术公司最早将裂殖壶菌应用于商业化生产。早在1991年，该公司就研究出了一套Schizochytrium sp.的培养工艺，培养48h后，菌体的生物量可达20g/L, DHA达细胞干重的10%^[2]。10多年前，Martek生物科技收购了Omega 生物技术公司，并已成功筛选出异养培养生产富含DHA的菌种，并在培养条件上进行了深入探索，将DHA产量提升到40-45g/L^[3]，并奠定了该公司在DHA生产市场的主导地位。近年来,我国研究DHA的一些科研单位对裂殖壶菌发酵产DHA的技术取得了一定进步，但从产量和质量来看，与国外机构相比还有一定差距。

1.1.3发酵合成DHA 代谢机理

长链多不饱和脂肪酸的合成在生物体内是一个大量需要乙酰-CoA、多种催化酶以及NADPH所提供的能量的碳链增长和消耗能量的过程。因为乙酰-CoA不能直接通过线粒体膜，所以它先和草酰乙酸缩合成柠檬酸，再依靠柠檬酸转运体系到达胞浆，在柠檬酸裂解酶(citrate lyase)裂解成乙酰-CoA和草酰乙酸。草酰乙酸在MDH和MC的作用下,产生 NADPH提供还原力,产生乙酰-CoA 合成脂肪酸。近年来,许多研究者发现裂殖壶菌合成DHA存在新的途径。Metz^[4]等通过对 Schizochytrium sp. ATCC20888多不饱和脂肪酸合成酶3个亚基的开放阅读框对比分析以及14C同位素标记推断：Schizochytrium sp. 极有可能通过聚酮合酶(PKS)催化合成 DHA。Wallis^[8]等人也揭示Schizochytrium sp.体内 DHA 生物合成不依赖碳链延长与脱氢反应,他们的研究成果进一步揭示了 DHA合成存在新的机制。2003年, Martek公司成功攻克了Schizochytrium sp.中编码 PKS途径中相关酶的基因序列^[10]，并于2006年对 Schizochytrium sp.中长链多不饱和脂肪酸合成酶以及I型的脂肪酸合成酶进行研究，提出在Schizochytrium sp.体内DHA的合成过程并不涉及脂肪酸脱氢酶和去饱和酶催化过程，而是由PKS途径合成^[13]。这是裂殖壶菌调控生产DHA代谢过程的新方法。但是仍需进一步研究此方法内DHA的合成机理。

1.2转氢酶循环中的关键酶

1.2.1丙酮酸羧化酶

丙酮酸羧化酶(Pyruvate Carboxylase PC)存在于细胞质中，分子量一般为65万。在分子内催化丙酮酸反应生成草酰乙酸，为三羧酸循环提供原料。丙酮酸羧化酶动物、植物、微生物中普遍存在，是一种有4个亚基的寡聚酶^[10]。

1.2.2苹果酸脱氢酶

苹果酸脱氢酶(Malate Dehydrogenase，MDH) 是生物糖代谢的关键酶之一，在各种生物体中普遍存在。MDH能催化苹果酸可逆转换为草酰乙酸，主要参与三羧酸循环、光合作用，C4循环等代谢途径。MDH根据辅酶特异性的差异可分为NAD-MDH和NADP-MDH^[12]。

1.2.3 苹果酸酶

苹果酸酶（Malic Enzyme，ME）是生物体内调控苹果酸氧化脱羧的关键。它在二价金属离子（Mg² 或Mn² ）存在的情况下能催化苹果酸反应，生成丙酮酸和CO2。在此过程中，伴随反应产生的NAD(P)H是转氢酶循环的关键^[13]。

1.3 生物信息学方法

1.3.1 生物信息学简介

生物信息学（bioinformatics）是一门多学科交叉结合运用的科学，伴随着计算机科学和生命科学蓬勃发展应运而生^[14]。基因测序技术已经发展到了第三代，各种生物序列信息触手可得，面对爆炸式的生物信息数据，快速有效的数据处理显得尤为重要^[25]。因此，生物信息学在生命科学的地位毋庸置疑。

1.3.2 生物信息学的主要研究内容

1.3.2.1 基于生物信息学的基因组学

基因组学是兴起于后基因组时代，因为人类和各种模式生物的基因组序列的获得，DNA信息爆炸式增长，但是这些大量数据信息的挖掘才刚刚开始^[3]。这是一项艰难的任务，在浩如烟海的数据库中，进行基因组的多序列比对，寻找具有最大相似性的基因；又或者，研究某一个基因的来源和进化方向，从而鉴定和预测未知基因的功能和结构^[15]。所以，如何高效且精确的处理现有的基因组信息成为了重中之重。因此，利用生物学和计算机学科交叉的产物——生物信息学，去分析、收集基因组的信息成为了基因组学的重要手段之一^[4]。基因组学又主要分为比较基因组学，结构基因组学和药物基因组学^[5]。因为基因组和胞内代谢以及蛋白的关系是密不可分的，所以比较基因组学就是对来自于不同个体或物种的基因组进行比对，利用一些算法，例如隐马尔科夫模型算命^[6]，揭示基因的功能，作用机制和进化方向。结构基因组学是指利用基因组的序列信息大量的模拟蛋白立体结构，从而根据结构与功能的关系，对它们分析预测。系统性的归类以及计算机的分析蛋白结构对于实现结构基因组学的所有价值至关重要^[7]。而兴起于后基因组时期的药物基因组学，关注人的基因组与药效、安全性的关系。根据基因检测的结果，因人施药，获得人道、安全又有效的结果^[8]。

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