论文总字数：25600字

摘 要

本论文首先通过设计三组不同发酵条件，即发酵合成培养基中的不同碳源，不同硫酸镁浓度，不同pH，从而对季也蒙毕赤酵母的发酵条件进行优化，经30 ℃摇床培养120 h后得到的最优发酵条件为：碳源：蔗糖；硫酸镁浓度：2.00 g/L；pH：5.00，其2-苯乙醇产量分别为1.23 g/L、1.36 g/L、1.44 g/L。后通过代谢工程手段改造季也蒙毕赤酵母，利用三组不同启动子和终止子内源表达酵母中艾氏途径的关键酶基因，即天冬氨酸转氨酶基因（aat）、芳香族转氨酶基因（aro8）、丙酮酸脱羧酶基因（pdc）和乙醇脱氢酶基因（adh）。然后接于含潮霉素B抗性基因的YPD平板培养基上筛选，获得目的重组季也蒙毕赤酵母。最后使用最优发酵条件于30 ℃摇床培养120 h后检测培养液中L-苯丙氨酸和2-苯乙醇浓度。根据实验结果，把利用强启动子构建的重组质粒导入原始酵母中可以过量表达酵母中艾氏途径对应的酶基因，从而提高2-苯乙醇的产量。原始酵母的2-苯乙醇产量为1.22 g/L，重组酵母GPD-AAT、GPD-ARO8、GPD-PDC、GPD-ADH、PGK-AAT、PGK-ARO8、PGK-PDC、PGK-ADH的2-苯乙醇产量分别比原始酵母提高了：17.30%、7.40%、8.30%、32.30%、0.60%、7.20%、32.40%、23.20%。

关键词：季也蒙毕赤酵母 发酵条件优化 艾氏途径 菌种改造 内源基因表达

Metabolic engineering of Meyerozyma guilliermondii for the production of 2-phenylethanol

Abstract

In this paper, three groups of different fermentation conditions including different carbon sources, different magnesium sulfate concentrations, and different pH in the fermentation synthesis medium were designed, so as to optimize the fermentation conditions of Meyerozyma guilliermondii. The optimal fermentation conditions obtained after 120 h culture in a shaker at 30 ℃ were carbon source: sucrose; magnesium sulfate concentration: 2.00 g/L; pH: 5.00, and the 2-phenylethanol yield was 1.23 g/L,1.36 g/L, 1.44 g/L, respectively.After that, Meyerozyma guilliermondii was transformed by metabolic engineering and three groups of different promoters and terminators were used to endogenously express the key enzyme genes named aspartate aminotransferase gene (aat), aromatic aminotransferase gene (aro8), pyruvate decarboxylase gene (pdc) and ethanol dehydrogenase gene (adh) of the Ehrlich pathway in yeast.Then it was screened on YPD plate medium containing hygromycin B resistance gene to obtain the target recombinant yeast.Finally, the concentration of L-phenylalanine and 2-phenylethanol in the culture medium was detected after 120 h culture in a shaker at 30℃ using the optimal fermentation conditions.According to the experimental results, introducing the recombinant plasmid constructed with strong promoter into the original yeast can overexpress the corresponding enzyme genes of the Ehrlich pathway in yeast, which can improve the production of 2-phenylethanol.The 2-phenylethanol yield of the original yeast was 1.22 g/L, and the recombinant yeast GPD-AAT, GPD-ARO8, GPD-PDC, GPD-ADH, PGK-AAT, PGK-ARO8, PGK-PDC and PGK-ADH increased by 17.30%, 7.40%, 8.30%, 32.30%, 0.60%, 7.20%, 32.40%, 23.20%, respectively.

Key words: Meyerozyma guilliermondii; Optimization of fermentation conditions; Ehrlich pathway; Strain modification; Endogenous gene expression

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

目 录 IV

第一章 文献综述 1

1.1 关于2-苯乙醇的概述 1

1.1.1 2-苯乙醇的性质及应用 1

1.1.2 2-苯乙醇的合成方法 1

1.2 莽草酸途径 2

1.3 艾氏途径 2

1.3.1 艾氏途径相关酶 3

1.3.2 影响艾氏途径合成2-苯乙醇的因素 3

1.4 提高2-苯乙醇产量的方法 4

1.4.1 菌株选育 4

1.4.2 代谢工程改造目的菌株 4

1.4.3 菌株的发酵条件优化 5

1.5 本论文的研究内容及拟采取的手段 6

1.6 本论文的研究意义 6

第二章 实验内容 8

2.1 仪器与试剂 8

2.1.1 仪器 8

2.1.2 试剂 8

2.1.3 酵母菌株 8

2.1.4 培养基 9

2.2 原始季也蒙毕赤酵母发酵条件优化 9

2.2.1 最适碳源的发酵条件优化选择 9

2.2.2 最适硫酸镁浓度的发酵条件优化选择 9

2.2.3 最适pH的发酵条件优化选择 10

2.3 重组质粒hph-GPD的构建 10

2.4 重组酵母TEF-目的基因（aat、aro8、pdc、adh）的构建及发酵 11

2.4.1 重组质粒hph-TEF-目的基因的构建 11

2.4.2 重组酵母TEF-目的基因的构建 11

2.4.3 重组酵母TEF-目的基因的发酵 12

2.5 重组酵母GPD-目的基因（aat、aro8、pdc、adh）的构建及发酵 12

2.5.1 重组质粒hph-GPD-目的基因的构建 12

2.5.2 重组酵母GPD-目的基因的构建 13

2.5.3 重组酵母GPD-目的基因的发酵 13

2.6 重组酵母PGK-目的基因（aat、aro8、pdc、adh）的构建及发酵 13

2.6.1 重组质粒hph-PGK-目的基因的构建 13

2.6.2 重组酵母PGK-目的基因的构建 13

2.6.3 重组酵母PGK-目的基因的发酵 14

第三章 结果与讨论 15

3.1 发酵条件优化的实验结果 15

3.1.1 最适碳源的发酵结果 15

3.1.2 最适硫酸镁浓度的发酵结果 15

3.1.3 最适pH的发酵结果 16

3.2 重组质粒hph-GPD的构建结果 17

3.3 重组酵母TEF-目的基因（aat、aro8、pdc、adh）的构建及发酵结果 17

3.3.1 重组酵母TEF-目的基因的构建结果 17

3.3.2 重组酵母TEF-目的基因的发酵结果 18

3.4 重组酵母GPD-目的基因（aat、aro8、pdc、adh）的构建及发酵结果 19

3.4.1 重组酵母GPD-目的基因的构建结果 19

3.4.2 重组酵母GPD-目的基因的发酵结果 20

3.5 重组酵母PGK-目的基因（aat、aro8、pdc、adh）的构建及发酵结果 21

3.5.1 重组酵母PGK-目的基因的构建结果 21

3.5.2 重组酵母PGK-目的基因的发酵结果 22

第四章 总结 24

参考文献 25

致 谢 28

1. 文献综述

1.1 关于2-苯乙醇的概述

1.1.1 2-苯乙醇的性质及应用

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