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摘 要

大肠杆菌作为一种微生物发酵法生产L-苏氨酸的主要微生物，是工业化大规模生产和发展创新的重点。本实验中，使用E. coli W1688菌，通过过表达和敲除生物膜的成膜相关基因fimH来探究其发酵产物L-苏氨酸的相关产量变化。首先通过发酵培养验证L-苏氨酸产量变化，在利用结晶紫染色法验证目的菌株的成膜状况，最后使用qRT-PCR的方法探究与L-苏氨酸代谢相关的基因相对表达量。结果表明，对于E. coli W1688，过表达fimH基因使得其生物膜在LB培养基中的相对表达提高了81.4%，在发酵培养基中提高了101%；相应的，敲除fimH导致生物膜相对表达在LB培养基中下降了15.2%，在发酵培养基中下降了14.6%。

在发酵实验中，过表达fimH的E. coli W1688菌株的苏氨酸产量上升了45.1%，达到了；敲除菌产量下降了14.3%。

最后在基因相对表达量的实验中，证实了对于fimH基因的改造的确影响了苏氨酸代谢通路上的主要基因，如thrA、thrB、thrC、rhtA、rhtB、rhtC；过表达fimH对于基因相对表达量的影响尤其明显，均表现出大幅上升。

关键词：生物膜 大肠杆菌 L-苏氨酸 fimH基因 qRT-PCR

Abstract

Escherichia coli, as a major microorganism producing L-threonine by microbial fermentation, is the focus of large-scale industrial production and development innovation. In this study, E. coli W1688 strain was used to investigate the changes of L-threonine production by overexpression and knockout of fimH gene related to biofilm formation. Firstly, the change of L-threonine production was validated by fermentation culture, and the film formation of the target strain was validated by crystal violet staining. Finally, the relative expression of genes related to L-threonine metabolism was explored by qRT-PCR. The results showed that for E. coli W1688, over-expression of fimH gene increased the relative expression of biofilm by 81.4% in LB medium and 101% in fermentation medium; accordingly, fimH knockout reduced the relative expression of biofilm by 15.2% in LB medium and 14.6% in fermentation medium.

In fermentation experiments, threonine production of E. coli W1688 strain overexpressing fimH increased by 45.1%, while that of knockout strain decreased by 14.3%.

In the end, it was confirmed that the modification of fimH gene did affect the main genes in threonine metabolism pathway, and the effect of over-expression of fimH on relative expression of genes was particularly obvious, which showed a significant increase.

Key words: Biofilm; L-threonine; E.coli; fimH gene; qRT-PCR

目录

第一章 文献综述 - 1 -

1.1苏氨酸 - 1 -

1.1.1苏氨酸的应用 - 1 -

1.1.2生产方法与研究现状 - 2 -

1.2大肠杆菌 - 3 -

1.3生物膜 - 3 -

1.1.5生物膜的形成过程 - 3 -

1.4 qRT-PCR - 4 -

第二章 实验部分 - 5 -

2.1药品和仪器 - 5 -

2.1.1 实验仪器 - 5 -

2.1.2 药品 - 6 -

2.1.3 培养基与缓冲液 - 7 -

2.2 目的菌株发酵产苏氨酸性能的研究 - 8 -

2.2.1 实验菌株 - 8 -

2.2.2 实验培养基 - 8 -

2.2.3 实验方法 - 9 -

2.3 生物膜相对表达的研究（结晶紫染色） - 11 -

2.3.1实验方法 - 11 -

2.4 目的菌株产苏氨酸主要相关基因相对表达量的研究 - 11 -

2.4.1 实验菌株 - 11 -

2.4.2 实验培养基 - 12 -

2.4.3 实验方法 - 12 -

第三章 结果与讨论 - 16 -

3.1 E. coli W1688、E. coli W1688-fimH*和E. coli W1688-ΔfimH发酵产苏氨酸性能的对比 - 16 -

3.2 E. coli W1688、E. coli W1688-fimH*和E. coli W1688-ΔfimH生物膜相对表达的对比 - 17 -

3.3 E. coli W1688、E. coli W1688-fimH*和E. coli W1688-ΔfimH产苏氨酸主要相关基因相对表达量的研究 - 18 -

第四章 结论与展望 - 23 -

4.1 结论 - 23 -

4.2展望 - 23 -

参考文献 - 24 -

致谢 - 26 -

第一章 文献综述

1.1苏氨酸

苏氨酸（L-threonine），人体所需八大必需氨基酸之一^[1]。苏氨酸有四种同分异构体，只有L-苏氨酸是天然且有活性的^[1]。

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