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摘 要

苹果酸是细胞代谢中重要的中间产物。针对苹果酸溢出现象，本实验使用CRISPRi技术，对大肠杆菌NAD 合成途径中的关键基因nadD进行编辑，成功得到了一株对nadD基因转录抑制达到3.21倍的重组菌株NCB05。然后采用三阶段发酵的方法生产苹果酸，即先使菌体有氧生长再厌氧产丁二酸，待发酵液中的葡萄糖耗尽再转为有氧转化，将丁二酸、乙酸等作为碳源生产苹果酸。在相同的发酵情况下，重组菌株NCB05发酵57h产生13.43 g/L的苹果酸，苹果酸产率提高了1.63倍。nadD基因转录受限能够有效提高大肠杆菌苹果酸的溢出效率。

关键词：苹果酸溢出 CRISPRi 转录抑制 三阶段发酵

Effect of nadD gene on synthesis of recombinant Escherichia coli L-malic acid

Abstract

Malic acid is an important intermediate in cell metabolism. In response to malic acid spillover, this experiment used CRISPRi technology to edit the key gene nadD in the E. coli NAD synthesis pathway, and successfully obtained a recombinant strain NCB05 that inhibited the transcription of nadD gene by 3.21 times. Then, the three-stage fermentation method is used to produce malic acid, that is, the cells are first aerobicly grown and then anaerobic to produce succinic acid, and the glucose in the fermentation liquid is depleted and then converted to aerobic conversion, and succinic acid, acetic acid, etc. are used as The carbon source produces malic acid. Under the same fermentation conditions, the recombinant strain NCB05 was fermented for 57 h to produce 13.43 g/L of malic acid, and the yield of malic acid was increased by 1.63 times. The transcriptional restriction of nadD gene can effectively improve the overflow efficiency of E. coli malic acid.

Keywords: malic acid spillover; CRISPRi; transcriptional inhibition; three-stage fermentation

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1前言 1

1.2 溢出代谢 1

1.3 NAD 合成途径 2

1.4 CRISPR/Cas系统 3

1.5本论文的研究内容与目的 4

第二章 构建AFP111抑制nadD基因表达的重组菌株 5

2.1 前言 5

2.2 材料与方法 5

2.2.1 实验菌株 5

2.2.2 分子改造所用试剂 7

2.2.3 实验试剂 7

2.2.4 实验仪器 8

2.2.5 培养基 8

2.2.6 打靶质粒pCDF-sgRNA-nadD的构建 9

2.2.7 制备DH5α感受态细胞 10

2.2.8 pCDF-sgRNA-nadD质粒的转化 10

2.2.9 pCDF-sgRNA-nadD质粒提取 11

2.2.10 AFP111电转感受态细胞的制备 11

2.2.11 pACYC-dCas9质粒电转化 11

2.2.12 AFP111/ pACYC-dCas9电转感受态细胞的制备 12

2.2.13 pCDF-sgRNA-nadD质粒电转化 12

2.2.14 nadD基因干扰情况的验证方法 12

2.3 结果与讨论 14

2.3.1 sgRNA的验证 14

2.3.2 荧光定量PCR的结果 15

2.4 本章小结 15

第三章 三阶段发酵产苹果酸 16

3.1前言 16

3.2 材料与方法 16

3.2.1实验菌株 16

3.2.2实验试剂 16

3.2.3实验仪器 17

3.2.4培养基 17

3.2.5培养方法 18

3.2.6分析检测方法 18

3.3 结果与讨论 19

3.3.1大肠杆菌AFP111第三阶段产苹果酸的情况 19

3.3.2重组菌株NCB05第三阶段产苹果酸的情况 19

3.4 本章小结 20

第四章 结论与展望 21

4.1 结论 21

4.2 展望 21

参考文献 22

致 谢 25

第一章 文献综述

1.1 前言

苹果酸又称2－羟基丁二酸，有两种异构体。其中L-苹果酸是细胞代谢中重要的中间产物，容易被人体吸收，性能优异，在化工、食品和医药行业有着巨大的市场^[1]。

制备苹果酸的主要方法有化学合成法、 酶转化法和微生物发酵法。使用化学方法制备的产物为DL混合型，副产物难以分离，不易被人体吸收还具有一定的毒副作用，限制了其产品在食品、医药领域的广泛应用。酶转化法是采用富马酸酶催化富马酸，而其生产过程存在对环境破坏严重、原料昂贵、产物杂酸含量偏高等缺陷。微生物发酵法由于原料价格低廉、副产物含量低、生产安全性高等优势，近年来日益受到重视^[2]。

在众多生产L-苹果酸的野生菌株中，使用较多的黄曲霉发酵具有较高的产物浓度及生产速率，但因生产菌株具有潜在代谢毒素隐患，影响其产品在食品、医药领域的应用；利用根霉菌也存在着发酵产物浓度低、副产物难以分离、发酵过程难以控制等问题^[3]。苹果酸的发酵生产工艺需要发展更为有效的生产系统。随着对苹果酸生物合成途径的深入研究，逐渐采用基因工程手段来调控微生物合成苹果酸，利用代谢工程^[4-5]调控代谢网络，提高产物质量。大肠杆菌由于遗传背景清楚、培养基成份简单且易培养，以及有大量可供选择的克隆或表达载体，适合大规模发酵，具有很高的经济价值。Mu等把大肠杆菌中的PEPC和酿酒酵母中的MDH克隆到枯草芽孢杆菌中，再敲除负责编码乳酸脱氢酶的基因，构建了BSUPML基因工程菌，苹果酸的最大产量可以达到15.6 mmol/L水平^[6]。Zhang等通过敲除产琥珀酸大肠杆菌KJ073中的延胡索酸还原酶、延胡索酸酶、苹果酸酶基因获得的重组大肠杆菌XZ658，经过有氧-厌氧两步发酵，厌氧阶段培养72 h苹果酸浓度达到34 g/L，产率为1.42 mol/mol，生产速率0.47 g/L/h^[7]。但目前制备苹果酸的发酵技术距离工业水平还有一定的距离。

本课题组在利用重组大肠杆菌AFP111厌氧发酵制备琥珀酸时，发现若在发酵结束后，通过有氧诱导，同时提供氮限制条件，原产物琥珀酸会被细胞作为碳源代谢合成苹果酸并分泌至胞外。

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