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摘 要

海因酶可以催化海因分解，最终得到在工业、农业、制药和食品等行业大量需要的D-氨基酸。对于常规获得D-氨基酸的化学合成法，除非使用不对称的起始化合物或催化剂，否则会以相同比例获得D型和L型立体异构体的混合物。因此外消旋混合物需是光学无活性的，并且必须分离立体异构体。通过非对映体盐的经典结晶分离对映体是最昂贵的生产步骤，并且在任何情况下该方法仅能产生50%的所需对映体。而酶促合成法相比成本低廉许多，并且可以提供D-氨基酸的光学纯度和100%产率，以及温和，环境友好的反应条件。本研究在文献调研的基础上，通过建立合适的实验方案，确定分析方法，在NCBI等网站上通过基因组数据库挑选出合适的D-海因酶序列huyA，随后对其进行克隆表达，研究其酶学性质。

关键词：D-海因酶；克隆表达；D-氨基酸；酶学性质

Abstract

hydantoinase catalyzes the decomposition of hydantoin, ultimately resulting in a large number of D-amino acids required in the industrial, agricultural, pharmaceutical and food industries. For the chemical synthesis which conventionally obtains D-amino acids, a mixture of D-forms and L-form stereoisomers is obtained in the same ratio unless an asymmetric starting compound or catalyst is used. The racemic mixture therefore needs to be optically inactive and the stereoisomers must be separated. Separation of enantiomers by classical crystallization of diastereomeric salts is the most expensive production step, and in any case the process produces only 50% of the desired enantiomer. Enzymatic synthesis is much less expensive and provides optical purity and 100% yield of D-amino acids, as well as mild, environmentally friendly reaction conditions. Based on the literature research, this study determined the analytical method by establishing a suitable experimental scheme, and selected the appropriate D-hydantoin sequence huyA from the NCBI website, and then cloned and expressed the enzyme.Study its enzymatic properties.

Key words: D-hydantoinase; clonal expression; D-amino acid; enzymatic properties

目 录

摘要 II

Abstract Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1 研究背景 1

1.1.1 D-氨基酸 1

1.1.2 海因酶 2

第二章 海因酶的重组表达 3

2.1 前言 3

2.2 实验材料 3

2.2.1 菌株和质粒 3

2.2.2 实验仪器 3

2.2.3实验试剂 4

2.2.4 工具酶 5

2.2.5 培养基及培养方法 5

2.3 实验方法 6

2.3.1 海因酶基因合成及质粒构建 6

2.3.2 重组质粒的诱导表达 6

2.3.3 核苷酸胶验证 6

2.3.4 粗酶液的制备 6

2.3.5 SDS-PAGE 6

2.3.6 海因酶活性测定 7

2.3.7 酶学性质研究 8

2.3.8 海因标品溶液的配制 9

2.4 结果与讨论 9

2.4.1 海因标准曲线 10

2.4.2 海因酶hyuA的质粒验证 11

2.4.3 海因酶hyuA的酶学性质 11

2.5 本章小结 14

第三章 结论与展望 15

4.1 总结 15

4.2 展望 16

参考文献 17

附 录 21

致 谢 22

第一章 文献综述

1.1 研究背景

1.1.1 D-氨基酸

D-氨基酸是制备半合成抗生素，农药、医药，食品等化学产品的高价值中间体。这些化合物被称为非天然氨基酸，并且变得越来越重要。D-氨基酸的典型实例是D-（苯基或苯基取代的）甘氨酸作为抗生素的中间体，如半合成青霉素和头孢菌素，D-丙氨酸用于生产食品甜味剂阿力甜、D-缬氨酸用于合成杀虫剂氟尿酸盐、D-瓜氨酸和D-高瓜氨酸用于生产有效的肠促激活释放激素（LH-RH）拮抗剂。

生产D-氨基酸有两种主要途径：化学合成和酶催化。关于常规化学合成，除非使用不对称的起始化合物或催化剂，否则会以相同比例获得D-和L-立体异构体的混合物。因此外消旋混合物是光学无活性的，并且必须分离立体异构体。通过非对映体盐的经典结晶分离对映体是最昂贵的生产步骤，并且在任何情况下该方法仅能产生50％的所需对映体。酶促合成可以解决上述问题，不仅可以提供D-氨基酸的光学纯度和100％产率，还能够提供温和，环境友好的反应条件。

最广泛使用的D-氨基酸生产酶法之一是乙内酰脲酶法，乙内酰脲酶即海因酶。该方法的最大优点是，使用来自广谱D，L-5-单取代乙内酰脲的相应底物可以获得任何光学纯的D-氨基酸，这种方法的难度和成本远低于化学合成法，还具有易于产品分离和回收的附加优点。在该级联反应中，化学合成的D，L-5-单取代的乙内酰脲环首先被立体选择性乙内酰脲酶（D-乙内酰脲酶）水解。催化所得N-氨基甲酰基D-氨基酸进一步水解，就可以得到游离的D-氨基酸，此方法优势远大于化学合成法。

1.1.2 海因酶

海因酶是一类催化水解海因、5-单替代海因及其海因衍生物内酰胺键水解的酶,在工业、医药、农业上具有广泛的应用价值，海因酶归类于环酰胺酶 [2]。

海因酶主要用于海因及其取代物的酶促外消旋化来进行手性氨基酸的生物合成。D-海因酶在工业、农业、医药领域应用十分广泛，它可以通过催化5-替代海因开环水解为N-氨甲酰-D-氨基酸，而N-氨甲酰-D-氨基酸可以在水解酶的作用下进一步水解脱去N-氨甲酰基，得到合成半合成抗生素、甜味剂、某些新型农药以及一些抗癌剂、抗菌剂所急需的D-氨基酸 [4]。

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