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摘 要

使用分子生物学的方法，以pBLUE-T为载体在宿主细胞DH-5α中重组表达了来源于P.dacunhae ATCC 20147 的L-天冬氨酸β-脱羧酶基因。确定重组载体的序列、Asd酶活及表达量。结果表明，L-天冬氨酸β-脱羧酶基因在DH-5α宿主菌中得到了成功表达，50 ml发酵液在37 ℃下24 h内可转化4 g L-天冬氨酸；与源宿主P.dacunhae ATCC 20147 相比，重组菌的转化率较低，L-天冬氨酸β-脱羧酶的蛋白表达量较低。

关键词：L-天冬氨酸-β-脱羧酶 分子生物学 L-天冬氨酸 L-丙氨酸

Cloning and expression of aspartate-β-decarboxylase gene

Abstract

Using the method of molecular biology, the L-aspartate β-decarboxylase gene derived from P. dacunhae ATCC 20147 was recombinantly expressed in the host cell DH-5α using pBLUE-T as a vector. The sequence of the recombinant vector, Asd activity and expression amount were determined.The results showed that the L-aspartate β-decarboxylase gene was successfully expressed in the DH-5α host strain, and 50 ml of the fermentation broth could transform 4 g of L-aspartic acid at 37 ° C for 24 h; Compared with P.dacunhae ATCC 20147, the conversion rate of recombinant bacteria was lower, and the protein expression level of L-aspartate β-decarboxylase was lower.

Key Words: L-aspartate-β-decarboxylase；molecular biology ；L-aspartate；L-alanine

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 前言 1

1.1 L-丙氨酸 1

1.1.1 L-丙氨酸的理化性质 1

1.1.2 L-丙氨酸的功能及应用 2

1.2 L-天冬氨酸β-脱羧酶 3

1.2.1 L-天冬氨酸β-脱羧酶的功能 3

1.2.2 L-天冬氨酸β-脱羧酶的理化性质 4

1.3 L-天冬氨酸β-脱羧酶脱羧制备L-丙氨酸 5

1.4 本论文的研究目的与内容 6

第二章 实验材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 菌株与质粒 7

2.1.2实验仪器 7

2.1.3 实验试剂 8

2.1.4 其他试剂的配制 9

2.1.5引物 10

2.1.6培养基 10

2.2实验方法 11

2.2.1基因组DNA的提取 11

2.2.2 PCR扩增 11

2.2.3 PCR产物胶回收 11

2.2.4酶切反应 12

2.2.5 连接反应 12

2.2.6 DH-5α感受态细胞的转化 12

2.2.7 天冬氨酸-β-脱羧酶的酶活测定方法 13

2.2.8筛选和鉴定 13

第三章 结果与讨论 16

3.1目的基因的克隆 16

3.1.1 基因来源 16

3.1.2 引物设计 16

3.2 重组T载体构建 17

3.2.1 重组子筛选 17

3.2.2 重组子质粒验证 18

3.3 酶切鉴定 19

3.4 酶活测定 19

3.5 序列比对 20

3.6 蛋白电泳 21

第四章 结论与展望 23

4.1 结论 23

4.2 展望 23

4.2.1 aspD基因克隆与表达工作的完善 23

4.2.2 重组菌的发酵条件优化 24

参考文献： 25

致谢： 28

第一章 前言

1.1 L-丙氨酸

1.1.1 L-丙氨酸的理化性质

镜像异构体——R-Ala和L-Ala的存在决定了Ala的手性。其中L-丙氨酸，作为合成蛋白质的单位，其在人类营养学，特别是在食品邻域中应用广泛。Ala的R基团是非极性的甲基，同时是一种脂肪族氨基酸。它的化学性能稳定，可溶于水(16.5% 25 ℃)和乙醇，不溶于乙醚和丙酮，呈无色至白色结晶状粉末，温度在gt;200 ℃时升华，264～296 ℃范围发生分解。L-丙氨酸的化学结构及其相关性质如表1所示。

表格 1 L-丙氨酸的理化性质

1.1.2 L-丙氨酸的功能及应用

1 L-丙氨酸的功能

作为氨基酸的一种，L-丙氨酸（又称氨基丙酸），具备多种重要生理功能，如参与生物体内糖的代谢、氨基酸的代谢、作为氨基供体参与转氨反应、参与糖源与氨基酸的转换等。它可以帮助肝脏处理和清除体内毒素，并保持血液中葡萄糖的正常水平。

2 L-丙氨酸的应用

在食品应用方面，L-丙氨酸可以且已经用作食品添加剂，是一种在许多食品中存在的氨基酸。它可与二元羧酸、氧化性酸混合，也可与辣椒油、山梨酸钾等混合，对多种食品、药品、化妆品等起到保险作用，从而作为防腐剂使用。L-丙氨酸因为其口感，对食物风味还具有独特的改善效果，可以搭配其他氨基酸，起到改善饮料食品风味的效果，起到风味调味料的作用。 L-丙氨酸对醛类有解毒作用，还可以促进酒精代谢，所以应用于氨基酸低度酒和饮料中。此外，它在强壮剂或强壮食品中也有所应用。

在医药应用方面，氨基酸是生物体内蛋白质的组成单位，影响生物生理活动的方方面面。L-丙氨酸可作为制备生化试剂和组织培养基的原料，也在氨基酸输液中发挥重要作用。它为转氨反应提供氨基供体，可治疗因肝功能障碍引起的糖尿病、急慢性肾功能衰竭、蛋白质代谢紊乱以及维持病人的营养需要。它还可以刺激胰高血糖分泌，在急慢性胰腺炎患者的高血糖素的研究中得到应用^[1]。L-丙氨酸可以大幅降低酒精作用于肝脏的损害，具有减肥作用^[2]，此外，L-丙氨酸还可用于制备血液保存剂 ^[3]。

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