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摘 要

1. 羟脯氨酸（L-Hydproline,L-Hyp）的分子式为C₅H ₉NO_3，它是羟基化的修饰产物为亚氨酸，是合成抗癌药物宜他霉素和microcolin A这种肽类抗生素的原料。顺式-4-L-羟脯氨酸（cis-4-Hyp）在化工、医药合成、食品添加剂中都存在重大的意义和影响。cis-4-Hyp生物转化合成的关键是使cis-P4H基因的有效表达和有效转化。

在本实验中，从NCBI中查询获得来自苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)中的顺式-脯氨酸-4-羟化酶的基因SmP4H，对其稀有密码子进行优化，将优化后的基因与质粒重组，形成重组质粒，于大肠杆菌中表达。诱导发酵后纯化重组蛋白，考察顺式-脯氨酸-4-羟化酶的动力学参数等酶学性质的研究 。

关键词：顺式-4-L-羟脯氨酸、顺式-脯氨酸-4-羟化酶、活性、稳定性

Cloning and expression of cis-4-proline hydroxylase and its enzymatic properties

Abstract

L-hypoproline (L-Hyp) is an imiline and does not belong to 20 common amino acids.cis-4-L-hydroxyproline has great significance and influence in chemical, pHarmaceutical synthesis and food additives. The efficient expression of the cis-P4H gene and the establishment of efficient transformation methods are key to the biotransformation of cis-4-Hyp.

In this experiment, the gene SmP4H encoding cis-proline-4-hydroxylase was obtained from Sinorhizobium meliloti, obtained from NCBI, optimized for rare codons, and ligated On the plaSmid pET-28a, the recombinant plaSmid PET-28a-cis-P4H was constructed and expressed in E. coli. The recombinant protein was purified after induction of fermentation, and the kinetic parameters of cis-proline-4-hydroxylase, the optimum temperature and temperature stability, the optimum pH value and the stability of pH value, and the influence of metal ions were investigated. Wait.

Key Words: cis-4-L-hyp, cis-p4h, activity, stability

目 录

摘要 Ⅰ

ABSTRACT Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1 羟脯氨酸 1

1.2 顺式-5-羟基哌啶甲酸 1

1.3 生物法合成顺式-5-羟基哌啶甲酸 2

1.3.1 脯氨酸羟化酶 2

1.3.2 顺式-4-脯氨酸羟化酶 3

第二章 顺式-4-L-羟脯氨酸羟化酶克隆表达 3

2.1 材料与方法 3

2.1.1 菌种 3

2.1.2 主要试剂和试剂配方 3

2.1.3 主要仪器 10

2.2 实验方法 11

2.2.1 cis-P4H 基因的优化与合成 11

2.2.2 cis-P4H 基因表达载体的构建 12

2.2.3 cis-P4H 的诱导、表达及纯化 14

2.3结果与分析 15

2.3.1 阳性克隆 PCR 验证 15

2.3.2 cis-P4H 的表达及纯化 16

第三章 顺式-4-L-羟脯氨酸羟化酶酶学性质研究 16

3.1 材料与方法 16

3.1.1 主要试剂和试剂配方 16

3.1.2 主要仪器 18

3.2 实验方法 18

3.2.1 酶学性质检测方法 18

3.2.2 动力学参数对cis-P4H活性的影响 20

3.2.3 cis-P4H最适反应温度测定 20

3.2.4 cis-P4H热稳定性测定 20

3.2.5 cis-P4H 最适反应 pH 测定 20

3.2.6 cis-P4H pH值稳定性测定 21

3.2.7 金属离子对cis-P4H活性的影响 21

3.3结果与分析 21

3.3.1 SmP4H动力学常数分析 21

3.3.2 温度对SmP4H的酶活性和稳定性的影响 22

3.3.3 不同pH对SmP4H的酶活性和稳定性的影响 22

3.3.4 不同金属离子对SmP4H的酶活性的影响 23

参考文献 24

致谢 25

第一章 文献综述

1.1 羟脯氨酸

L-羟脯氨酸的分子式为C₅H ₉NO_3，它是羟基化的修饰产物，因此根据羟基修饰的位置分为3-l-羟脯氨酸和4-l-羟脯氨酸。其两个碳原子呈不对称分布，因此，它有四个异构体分别为顺式、反式3-l-羟脯氨酸和顺式、反式4-l-羟脯氨酸^[1-2]。顺-4-L-脯氨酸作为含有特定的生物活性氨基酸，是哺乳动物骨胶原蛋白的重要组成部分^[3]。它也是肝脏和胆囊的重要组成部分。其也是合成抗癌药物宜他霉素和microcolin A这种肽类抗生素的原料^[4]。因此顺式-4-L-羟脯氨酸在化工、医药合成、食品添加剂中都存在重大的意义和影响。合成顺式-4-L-羟脯氨酸的方法主要有胶原水解、化学合成以及生物合成。胶原水解是由动物胶原蛋白的酸水解产生的，但这一过程存在严重的缺点，比如过多反应和纯化步骤导致的低生产率，有害和有毒溶剂的需要以及废料的出现。然而，化学合成也存在一些严重的缺点比如说造成严重的环境污染、产物难以分离纯化等等。因此寻找低污染、低成本、高转化率的生产方法迫在眉睫。

我国从上个世纪 80 年代以来就加强了羟脯氨酸的研究和生产，但因提取工艺落后、得率低，均在( 4～5) %，又由于耗能、耗水高，环境污染严重，部分厂家已停止生产。由于骨胶可被用来提取羟脯氨酸和其它氨基酸，许多国家从我国进口大量动物骨胶，提取氨基酸后再以高价返销我国。中国对羟脯氨酸的年需求量估计为550吨。目前，在中国国内主要依靠进口来获取羟脯氨酸。因此，通过研究获得一种适宜的低成本、转化率高的羟脯氨酸制备方法是具有重大的实践意义。

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