论文总字数：19551字

摘 要

线性α-烯烃是一种重要的有机化工原料和生物燃料。本论文通过基因工程的手段，首先成功构建了含有P450 oleT_JE基因序列的重组质粒pET-duet-his-oleT，实现目的蛋白的表达；然后，对重组菌株BL21（DE3）-oleT的产酶的基本条件进行了优化，得到了诱导最适诱导OD₆₀₀为0.9，IPTG 0.5 mM，诱导时长18 h，诱导后培养的温度为18℃；接下来对该酶的酶学性质进行了研究，结果显示当pH为7.0，反应温度为30℃时酶的活性最好，同时探究不同种类的有机试剂及其浓度以及不同种类的表面活性剂及其浓度对oleT_JE酶的影响。研究结果对今后oleT_JE体外反应条件的确定和优化提供了有益参考，从而对P450 oleT_JE脂肪酸脱羧酶催化线性α-烯烃的合成提供了一定的基础。

关键词：P450脂肪酸脱羧酶 oleT_JE 线性α-烯烃 酶学性质

P450 oleT_JE Catalyzed Synthesis of Linear α-Alkene from Fatty Acids

Abstract

Linear alpha-olefins are an important organic chemical and biofuel. In this paper, the recombinant plasmid pET-duet-his-oleT containing P450 oleT_JE gene sequence was successfully constructed by genetic engineering to achieve the expression of the target protein. Then, the enzyme production conditions of recombinant strain BL21 (DE3) - oleT were optimized. The optimum initial OD₆₀₀ was 0.9, the concentration of IPTG was 0.5mM, the optimum induction time was 18 h, and the optimum induction temperature was 18℃. Then the enzymatic properties of oleT_JE were studied. The results showed that the activity of oleT_JE was the best when the pH was 7.0 and the reaction temperature was 30℃. At the same time, the effects of different kinds of organic reagents and their concentrations, as well as different kinds of surfactants and their concentrations on oleT_JE were explored. These results provide a useful reference for the determination and optimization of oleT_JE in vitro reaction conditions, which provides a basis for the synthesis of linear α-olefins catalyzed by P450 oleT_JE fatty acid decarboxylase.

Key words：P450 fatty acid decarboxylase; oleT_JE; Linear alpha olefin; Enzymatic propertie

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文章综述 1

1.1线性α-烯烃的概述 1

1.2线性α-烯烃的合成方法 1

1.2.1化学合成法 1

1.2.2生物法合成线性α-烯烃 1

1.3脂肪酸脱羧酶 oleT_JE结构及催化机理 3

1.4 P450脂肪酸脱羧酶oleT_JE酶的研究与前景 4

1.5本论文的研究背景与意义 4

1.6本论文的内容 4

第二章 材料与方法 6

2.1实验材料与方法 6

2.1.1菌株与质粒 6

2.1.2酶与主要试剂 6

2.1.3实验仪器 6

2.1.4脂肪酸、烯烃标准品配制 6

2.2菌株方法 7

2.2.1质粒的构建 7

2.2.2连接与转化 7

2.3微生物的培养 8

2.3.1平板培养 8

2.3.2种子培养 8

2.3.3摇瓶培养 8

2.3.4培养基和实验中配制的主要溶液 8

2.3.5蛋白表达与纯化 8

2.3.6蛋白浓度测定 9

2.4酶学性质的研究 9

2.4.1 oleT_JE 的最适反应pH的研究 9

2.4.2 oleT_JE的最适反应温度的研究 9

2.4.3 oleT_JE的热稳定性的研究 10

2.4.4 oleT_JE对有机试剂耐受性的研究 10

2.4.5 气质色谱分析检测 10

第三章 结果与讨论 11

3.1含P450 oleT_JE酶编码基因重组质粒的构建 11

3.2 P450 oleT_JE酶产酶条件的优化 12

3.2.1不同诱导温度对产酶的影响 12

3.2.2不同诱导剂浓度对产酶的影响 13

3.2.3不同诱导时长对产酶的影响 14

3.2.4不同诱导OD对产酶的影响 15

3.3 酶学性质的研究 16

3.3.1 oleT_JE的最适反应pH的研究 16

3.3.2 oleTJE的最适反应温度的研究 17

3.3.3 oleT_JE的热稳定性研究 18

3.3.4 oleT_JE对有机试剂耐受性的研究 19

3.3.5表面活性剂种类对oleT_JE酶的影响 19

第四章 结论与展望 21

参考文献 22

致 谢 24

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